[发明专利]一种抗弓形虫棒状体蛋白4（ROP4）单克隆抗体及其制备方法与应用

说明书

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种抗弓形虫棒状体蛋白4的单克隆抗体及其制备方法与应用。本发明抗ROP4的单克隆抗体由杂交瘤细胞株3B‑7分泌产生，可用于犬、猫、猪和鸡血清、血浆弓形虫循环抗原的检测，其针对弓形虫蛋白检测的最低限度为17.71ng/mL。本发明通过细胞融合技术获得的一株鼠源杂交瘤细胞株3B‑7，能够稳定分泌抗ROP4的单克隆抗体，经过鉴定发现该单克隆抗体具有效价高、特异性强等优点，为进一步应用于临床弓形虫病原的检测奠定基础。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及抗弓形虫棒状体蛋白4单克隆抗体及其制备方法与应用。

背景技术

弓形虫属原生动物门、孢子虫纲、弓形虫属，是一种细胞内寄生机会致病原虫，能感染几乎所有的温血动物，引起人畜共患疾病。弓形虫极大威胁着人类的身体健康，尤其是孕妇和免疫力低下者。孕妇和孕畜在孕期，感染弓形虫会发生流产或产死胎。而对HIV、器官移植、癌症病人等免疫力低下者，弓形虫感染是引起死亡的重要因素。同时弓形虫病爆发也会给畜牧业带来重大经济损失。

弓形虫病感染的严重后果，迫切需要我们重视研究弓形虫病的诊断方法。传统的诊断方法，包括病原学诊断、免疫学诊断和分子生物学诊断等，各有利弊，单克隆抗体特异性强且在弓形虫检测方面已有应用。单克隆抗体在免疫印迹和免疫荧光的结果上具有特异性好、敏感度高、纯度高的优点，用于检测样品中是否感染弓形虫的试剂盒，能够在弓形虫免疫学诊断上提供较为准确的检测手段，特别适合用于生产实践的现场快速诊断。

棒状体蛋白(Rhoptry proteins,ROPs)，又称为棒状体蛋白激酶，在虫体入侵过程中起到了重要作用，主要包括2个家族：ROP1和ROP2家族，其中ROP4属于ROP2家族。ROP4在入侵过程中可以促进纳虫泡的形成，在对宿主细胞的黏附、入侵和细胞内的复制等过程中起作用，具有较好反应原性以及较强的免疫原性，是一个很好的疫苗候选抗原。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种抗弓形虫棒状体蛋白4单克隆抗体，该单克隆抗体的制备方法及其在制备用于检测弓形虫病感染的免疫检测工具中的应用。本发明以弓形虫ROP4蛋白为免疫原免疫小鼠，制备阳性单克隆杂交瘤细胞株，并通过诱生腹水与纯化，得到弓形虫ROP4蛋白单克隆抗体，该单克隆抗体具有特异性好、敏感度高、纯度高的优点，具备较高检测灵敏性与特异性，为进一步应用于临床弓形虫病原的检测奠定基础。

本发明第一方面提供一种杂交瘤细胞株，所述的杂交瘤细胞株分泌抗弓形虫棒状体蛋白4单克隆抗体。

本发明第二方面提供一种弓形虫棒状体蛋白4的单克隆抗体，所述的抗弓形虫棒状体蛋白4单克隆抗体特异性识别弓形虫棒状体蛋白4，所述的单克隆抗体由本发明第一方面所述的杂交瘤细胞株分泌所得。

在本发明一实施例中，所述弓形虫棒状体蛋白4的GenBank登录号或者NCBI的ID或其他公众可以接触的数据库的，可以查到ROP4基因序列的编号。

在本发明一实施例中，所述抗弓形虫棒状体蛋白4单克隆抗体的重链编码核苷酸序列是与SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的同源性不低于90％、95％、98％、99％的核苷酸序列；所述抗弓形虫棒状体蛋白4单克隆抗体的轻链编码核苷酸序列是与SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的同源性不低于90％、95％、98％、99％的核苷酸序列。

在本发明一优选实施例中，所述抗弓形虫棒状体蛋白4单克隆抗体的重链编码核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示核苷酸序列。

在本发明一优选实施例中，所述抗弓形虫棒状体蛋白4单克隆抗体的轻链编码核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示核苷酸序列。

在本发明一实施例中，所述抗弓形虫棒状体蛋白4单克隆抗体的重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的核苷酸编码序列分别如SEQ ID NO.7-9所示；轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的核苷酸编码序列序列分别如SEQ ID NO.13-15所示。