[发明专利]一种K252A发酵培养基及其制备方法

说明书

本发明公开了一种K252A发酵培养基及其制备方法，该发酵培养基通过优化的组分搭配，外加氯化胆碱、丁二酸二钠、蛋氨酸等功能因子，既能为拟诺卡氏菌种生长、代谢提供营养，经代谢转化后又能为K252A生物合成提供中间体，最终获得高产K252A的发酵液。使用本发明所述发酵培养基，摇瓶发酵9天，K252A效价高于2.60g/L。通过控制pH、溶氧两个关键工艺条件，同时优化葡萄糖和功能因子的补料控制策略，培养至约264h，K252A效价可达5.79g/L，较文献报道的水平显著提高，具备了工业化生产的基础。

技术领域

本发明涉及工业微生物发酵技术领域，具体涉及一种K252A发酵培养基及由该发酵培养基制备K252A的方法。

背景技术

K252A，CAS号99533-80-9，是1986年由HIROSHI KASE等人从拟诺卡氏菌培养物中分离得到的代谢产物，之后完成结构鉴定，最终确认是星形孢菌素的类似物，是一种强效的蛋白激酶C和酪氨酸激酶的抑制剂，IC₅₀值为32.9nM。目前，大量文献报道了抗生素K252A具备有效的抗肿瘤活性，但是在体外研究显示没有抗微生物活性或啮齿类动物的体内毒性。更广泛的研究已证明抗生素K252A是一种有效的Ca²⁺/钙调蛋白激酶II抑制剂，它也能抑制其他的激酶活性，特别是肌球蛋白轻链激酶，环磷酸腺苷依赖蛋白激酶(PKA)，蛋白激酶C(PKC)和cGMP依赖的蛋白激酶(PKG)。

已知拟诺卡氏菌种(Nocardiopsis sp.)可以生产K252A，HIROSHI KASE于1986年进行了简要的报道外，但其得到的发酵液中K252A含量仅约为110μg/ml(Hiroshi Kase,Kazuyuki Iwahashi,Yuzuru Matsuda.K-252a,a Potent Inhibitor of Protein KinaseC from Microbial Origin[J].The Journal of Antibiotics,1986,39(8):1059-1065.)。Mitsutaka Kino曾报道其在发酵罐中K252A的发酵水平达到2g/L，但至今未见其有后续文献公开(Mitsutaka Kino,Kenzo Shono,Tetsuo Nishinura,et al.PracticalPreparation of K-252a from a Fermentation Solution[J].Biosci.Biotechnol.Biochem.,1998,62(8):1627-1629.)。Sanjay R.Chemburkar等在专利US20090239271A1中报道其K252A发酵水平为1～4g/L，并对K252A的分离方法进行了保护，但未公开其具体的发酵培养基配方和发酵培养方法。

发明内容

为了提高K252A的产量，本发明以拟诺卡氏菌种(Nocardiopsis sp.)作为生产菌种，对发酵培养基和发酵方法进行研究优化，最终获得一种发酵培养基及由该发酵培养基制备K252A的方法。该培养基和方法为拟诺卡氏菌种生长提供充足的营养的同时，能促进拟诺卡氏菌种的代谢速度，通过功能因子的代谢转化，为K252A的生物合成提供了中间体，最终大幅度提升了K252A的发酵产量。

一种K252A的发酵培养基，所述发酵培养基包括以下重量百分含量的组分：

其中，所述功能因子为：

氯化胆碱、丁二酸二钠、蛋氨酸三者的组合，其中氯化胆碱含量为发酵培养基重量的0.01～0.05％，丁二酸二钠含量为发酵培养基重量的0.08～0.4％，蛋氨酸含量为发酵培养基重量的0.26～1.3％。

优选的，所述碳源为下列中的一种或两种或多种的组合：甘油、糊精、可溶性淀粉、麦芽糖、油酸甲酯。所述碳源包括速效、缓效碳源，主要用于不同时期为菌体生长、繁殖提供所需能量和合成菌体所需的碳成分，刺激菌丝生长，同时为产物合成提供碳骨架。