[发明专利]提高基因编辑效率的Cas9融合蛋白、编码基因及其应用

权利要求书

1.Cas9融合蛋白的编码基因，其特征在于核苷酸序列如Seq ID No.10中的1～4221位核苷酸所示。

2.含有权利要求1所述的编码基因的表达载体。

3.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于:所述的表达载体含有核苷酸序列如Seq ID No.10所示的Cas9融合蛋白表达框。

4.根据权利要求2或3任一项所述的表达载体，其特征在于:还含有gRNA克隆及转录单元，可共表达Cas9融合蛋白和gRNA。

5.权利要求2～4任一项所述的表达载体在构建水稻CRISPR-Cas9基因编辑系统中的用途。

6.水稻CRISPR-Cas9基因编辑的方法，其特征在于：使用了权利要求2～4任一项所述的表达载体为CRISPR-Cas9基因编辑系统提供Cas9蛋白活性。

7.根据权利要求6所述水稻CRISPR-Cas9基因编辑的方法，其特征在于包括以下步骤：

a、骨架载体构建：以pTX172载体为基本骨架，将权利要求1所述的Cas9融合蛋白编码基因替换其中的Cas9蛋白编码基因，构建CRISPR-Cas9骨架载体；

b、定向基因编辑载体构建：针对待编辑的目标基因设计基因编辑位点及sgRNA，人工合成sgRNA的引物对，将引物对退火形成带粘性末端的双链DNA，将双链DNA替换pTX172载体骨架中的ccdB元件，获得定向编辑表达载体；

c、定向基因编辑及检测：使用步骤b得到定向编辑表达载体转化原生质体，检测原生质体的基因定向编辑情况，将成功定向编辑的原生质体培养得到定向基因编辑植株；

或者；

使用步骤b得到定向编辑表达载体转入根癌农杆菌，通过农杆菌介导的遗传转化方法，将上述载体导入目标植物，获得定向基因编辑植株。