[发明专利]一种联合检测EGFR基因突变的试剂盒及方法

说明书

本发明公开了一种联合检测人类EGFR基因突变检测试剂盒，本发明包括的引物和探针包括SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:32；可以对EGFR1基因上T790M、L858R、19del、G719X，S768I和L861Q突变进行检测，可以在一个反应管中同时检测出多种突变；灵敏度较高，可以检测出3‑10拷贝数；高特异性，10ng/ul野生型质粒不会产生非特异性信号；检测快速高效，操作简单，费用低廉。

本申请主张中国在先申请，申请号201910238686.0申请日：2019年3月27日的优先权。

技术领域

本发明涉及生物技术和医学领域，具体涉及基于荧光探针和聚合酶链式反应(PCR)的EGFR基因突变检测试剂盒及方法。

背景技术

目前，肺癌已成为全球癌症死亡的首要原因，全球每年新发病例150万，严重威胁人类健康。在肺癌患者中，非小细胞肺癌(NSCLC)约占85％，且就诊时80％已失去手术或放射治疗最佳机会，致使其长期生存率低，疗效令人堪忧。ⅢB/Ⅳ期非小细胞肺癌2年生存率仅10.20％，中位生存时间仅10-12月。因此，人们需要不断研究新的治疗方法以提高肺癌治疗的有效率，其中以分子靶向治疗为代表的新治疗方法，为晚期NSCLC的治疗带来了新的希望和曙光。

表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)是目前NSCLC治疗最重要的分子靶点，其是原癌基因C-erbB-1(HER-1)的表达产物，基因定位于第7号染色体短臂(7p12)，全长200Kb，由28个外显子组成。C-ErbB-1的编码产物EGFR为含有1210个氨基酸残基的单一多肽链前体，其中24个氨基酸为信号肽段，在翻译加工时被裂解，故成熟的EGFR是由1186个氨基酸组成的酪氨酸蛋白激酶，分子量约为170KDa。肺腺癌患者EGFR基因敏感性突变阳性率在亚裔人群和我国均为50％左右。随着对非小细胞肺癌发病机制进一步的研究以及对其分子生物学行为的深入探讨，有针对性的分子药物靶向治疗成为治疗晚期非小细胞肺癌很有前景的治疗方式。表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂(epidermalgrowth factor receptor tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKIs)包括厄洛替尼(erlotinib)和吉非替尼(gefitinib)等，在治疗晚期NSCLC方面发挥了很重要的作用，效果显著，现已成为一线药物，为患者的治疗带来的很大的希望，广泛受到大家的认可。EGFR-TKIs在改善晚期非小细胞肺癌患者总生存期和无进展生存期方面有很显著的作用，然而，经过一段时间的临床治疗后，发现有一大部分患者会对EGFR-TKIs产生耐药性，大大限制了临床的应用，所以进一步分析研EGFR表达于正常上皮细胞表面，而在一些肿瘤细胞中经常过表达，与肿瘤细胞的转移、侵润、预后差有关。EGFR常发生突变，其酪氨酸激酶区域的突变主要发生在18-21号外显子，在中国肺癌患者中，EGFR突变率占30-50％，其中19和21号(L858R,L861I)外显子突变率占总突变率的90％左右，18号外显子突变占总突变率的5％左右，20号外显子上T790M突变占突变率的5％左右。

目前EGFR基因突变的检测方法主要包括以下几种：

(1)Sanger测序法是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得可见DNA碱基序列的一种方法。测序的过程检测周期较长且较繁琐，消费昂贵，通量不高，灵敏度较小，只能检测突变比例在10％-20％以上的基因突变，因此不适用于临床上大量样本的分析与研究。