[发明专利]一种快速高效的茶树质体型谷氨酰胺合成酶基因定位方法有效
申请号: | 201910700388.9 | 申请日: | 2019-07-31 |
公开(公告)号: | CN110412263B | 公开(公告)日: | 2023-01-31 |
发明(设计)人: | 刘美雅;张群峰;倪康;石元值;马立峰;伊晓云;汤丹丹;阮建云 | 申请(专利权)人: | 中国农业科学院茶叶研究所 |
主分类号: | G01N33/543 | 分类号: | G01N33/543;G01N33/573;G01N21/64 |
代理公司: | 北京润川律师事务所 11643 | 代理人: | 张超 |
地址: | 310000*** | 国省代码: | 浙江;33 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 快速 高效 茶树 质体 谷氨酰胺 合成 基因 定位 方法 | ||
1.一种快速高效的茶树质体型谷氨酰胺合成酶基因定位方法,其特征在于,试验当天将新鲜幼嫩的茶树叶片样品置于PBS缓冲液中,琼脂糖凝胶包埋固定后,于震荡切片机中切成50-100μm切片,获得的茶树叶片横切片分别与茶树CsGS2特异抗体、商业抗体二抗杂交,最后于激光共聚焦显微镜下拍照;
所述PBS缓冲液的浓度为0.1mol/L;
所述琼脂糖凝胶为5%的琼脂糖凝胶;
包括以下步骤:
S1.采用RACE法获得CsGS2基因序列全长,如氨基酸序列如SEQ ID NO.:2所示,根据所获得的序列进行基因特异抗体的合成;
S2.将茶树扦插苗,在完全营养液中进行水培,取新生长叶片于PBS缓冲液中;
S3.配置琼脂糖凝胶,待凝胶温度到50-60℃时,将上述茶树组织置于凝胶中,随后室温冷却至凝胶凝固,此步骤是完成新鲜茶树组织的固定;
S4.将固定好的茶树组织,置于振荡切片机上进行横切,切片厚度50-100μm,切好的叶的横切片室温孵育于PBS缓冲液中;
S5.用含5%BSA的磷酸缓冲液封闭30分钟后,用PBS缓冲液冲洗四次;
S6.在含基因特异性抗体的PBS缓冲液中杂交孵育,用PBS缓冲液冲洗四次;之后用含商业抗体Alexa Fluor 555goat anti-rabbit IgG的PBS缓冲液中杂交孵育;最后再用PBS缓冲液多次冲洗;
S7.将切片平铺于载玻片上,压片后于激光共聚焦显微镜下进行荧光观察并拍照;
步骤S3中所述琼脂糖凝胶为5%的琼脂糖凝胶;
步骤S4中所述PBS缓冲液的pH为7.4;
步骤S5和步骤S6中所述PBS缓冲液的浓度为0.1mol/L;
步骤S6中每次杂交孵育时间为1-2小时;
步骤S6中所述基因特异性抗体为茶树质体型谷氨酰胺合成酶基因CsGS2;
步骤S7中所述激光共聚焦显微镜为蔡司710双光子激光共聚焦显微镜。
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