[发明专利]一种酸性哺乳动物几丁质酶编码基因和应用

说明书

本发明公开了一种酸性哺乳动物几丁质酶编码基因和应用，该基因具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。本发明利用体外构建无抗生素筛选标记的多拷贝的方法，实现了酸性哺乳动物几丁质酶的高量表达，同时利用辅助因子Hac1的共表达，实现了酸性哺乳动物几丁质酶表达量的进一步提高。

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，具体而言，涉及一种酸性哺乳动物几丁质酶编码基因、重组载体、转化体和应用。

背景技术

几丁质(甲壳素)是由N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖通过β-1,4-糖苷键连接起来的直链多聚物,是最丰富的天然高分子化合物之一。几丁质经几丁质酶水解后的产物几丁二糖，在医药保健等领域具有很高的应用价值。根据几丁质酶作用时的切割位点不同,可将几丁质酶分为内切几丁质酶和外切几丁质酶两大类。内切几丁质酶在几丁质链内部随机切割，产生分子量更小的几丁寡糖；外切几丁质酶催化底物水解时从几丁质链的还原末端或非还原末端释放(GlcNAc)₂，以及可以分解内切几丁质酶产生的低聚物为单体的β-N-乙酰氨葡萄糖苷酶。

由于天然甲壳素在一般溶剂中或中性条件下不可溶解，大大降低了其水解效率，因此需要经过繁琐的步骤制备成胶体几丁质才能被酶水解。另外，在酸性条件下几丁质的溶解性显著增加，从而可提高几丁质酶的水解效率，因此酸性几丁质酶(AMCase)在几丁质的水解上表现出明显的优势。然而，目前虽然有研究报道酸性几丁质酶在大肠杆菌宿主中进行异源表达，但是存在表达量比较低，以及活性低的问题，使其在工业应用方面存在明显的弊端。

通过检索国内外现有技术，尚未发现酸性哺乳动物几丁质酶在宿主中大量表达的方法应用。

发明内容

鉴于现有技术的不足，本发明的第一个目的在于通过优化现有的哺乳动物几丁质酶基因序列，从而提供一种酸性哺乳动物几丁质酶编码基因和重组载体、转化体以及遗传工程化的宿主细胞。

为了实现本发明的目的，发明人通过大量试验研究并不懈努力，最终获得了如下技术方案：

一种酸性哺乳动物几丁质酶的编码基因，该基因经过碱基优化后具有SEQ IDNO.2所示的核苷酸序列。另外，该基因编码具有seq NO.1所示的氨基酸序列的蛋白质。

一种重组载体，该重组载体包含上述几丁质酶的编码基因，所述编码基因的拷贝数为4。

进一步优选出多组重组载体，所述重组载体是在pHBM905M载体的Cpo I和Not I位点插入所述酸性哺乳动物几丁质酶的编码基因而得，进而通过串联表达框，得到含有4拷贝的重组载体。

本发明还提供两种转化体，转化体可以为重组菌，其包含上述重组载体。例如，将酸性哺乳动物几丁质酶基因插入载体pHBM905M的Cpo I和Not I位点得到的重组表达载体，及含有基因多拷贝表达框的重组表达载体转化至毕赤酵母GS115得到重组菌。另外一种转化体为以酸性哺乳动物几丁质酶4拷贝GS115重组菌，再次转入辅助因子(Hac1、Pdi1和Mrx1)进行共表达的新型重组菌。

本发明还提供多对引物，用于扩增上述的酸性哺乳动物几丁质酶编码基因全长及共表达所需的各种辅助因子。

一种遗传工程化的宿主细胞，所述的宿主细胞含有上述的重组载体。进一步优选地，所述遗传工程化的宿主细胞除含有几丁质酶4拷贝的重组载体外，还包含插入辅助因子Hac1基因序列的重组载体。所述重组载体为载体pGAPZB的EcoR I和Age I位点插入目标基因得到的重组表达载体。

哺乳动物几丁质酶首次在小鼠体内发现，属于真核细胞来源的基因。而本发明人选用的毕赤酵母GS115存在真核基因具有的翻译后修饰特点，且能够进行分泌表达和高密度发酵，满足工业化应用的条件。因此，我们选择毕赤酵母GS115作为出发菌株进行酸性哺乳动物几丁质酶的表达。