[发明专利]利用转录激活因子样效应物核酸酶技术培育软米的方法

说明书

本发明公开了一种利用转录激活因子样效应物核酸酶技术培育软米的方法。具体过程是：通过基因序列分析，从水稻淀粉合成酶GBSSI基因组DNA中筛选两段专一核苷酸序列，分别构建两段靶位点序列的转录激活因子效应子识别模块，并与FokI II核酸酶表达单元串联。获得靶向GBSSI基因TALEN的植物表达载体SFokIAB[TN12ab]，然后将表达载体通过农杆菌介导转化到水稻中。利用本发明，可以显著降低稻米中直链淀粉的含量，从而获得优质的软米。

技术领域

本发明属于植物生物技术领域，具体地说利用转录激活因子样效应物核酸酶技术，定向剪切水稻淀粉合成酶GBSSI基因，培育出低直链淀粉含量的软米。

背景技术

淀粉最稻米中主要成分，由支链淀粉(70%-80%)和直链淀粉( 20%-30%) 组成。淀粉分子以淀粉颗粒的形式存在于大米中，其形状大多是不规则的多边形，稻米的淀粉粒直径在3-10μm 之间。高等植物淀粉的合成是在质体中进行的，淀粉的形成是通过高分子量的聚合体结晶而完成的，高分子量的聚合体包括无定形淀粉分子、蛋白质以及脂类物质。淀粉合成的整个过程主要由四大酶类协同完成，包括ADP(二磷酸腺苷)-葡萄糖焦磷酸化酶、淀粉合成酶、淀粉分支酶和淀粉去分支酶。

淀粉合成酶是以ADPG为葡萄糖供体，对葡萄糖聚合体通过糖基转移而催化α-1，4糖苷键延长作用的酶。根据水溶性的不同，淀粉合成酶分为淀粉粒结合淀粉合成酶(GBSS)和可溶性淀粉合成酶(SSS)，前者的功能是合成直链淀粉，而后者的功能则是合成支链淀粉。

颗粒结合淀粉合成酶由蜡质基因(Waxy，Wx) 编码，包裹于淀粉粒中。水稻GBSS由两个基因编码GBSSⅠ和GBSSⅡ(Denye, Plant Cell Environ,1995,18(9):1019-1026)。其中GBSS I只在储藏组织中表达，控制胚乳等贮藏器官中直链淀粉的合成；而GBSSⅡ在根、茎、叶等营养器官中表达，负责瞬时淀粉的合成 (Dial,Planta,2003, 218(2):261-268)。在水稻中,GBSSI由蜡质基因Wx编码,Wx位于第6染色体上,蛋白质大小为60kD 左右。Wx基因是影响稻米蒸煮与食味品质的最重要基因，通过编码淀粉粒结合淀粉合成酶(GBSSI)控制着稻米中直链淀粉的合成，直接影响水稻胚乳和花粉中直链淀粉的含量(AC)。非糯性基因(Wx)对糯性基因(wx) 表现为不完全显性，存在较为明显的剂量效应，Wx基因等位变异的挖掘和利用是解析水稻质量变异一个重要的方法，也是稻米品质改良的一个重要方面。大量研究表明,Wx 外显子和内含子的结构发生改变,都将影响其表达量和蛋白质功能，目前在栽培稻中已鉴定了7个Wx基因的复等位变异，包括Wxb、wx、Wxop、Wxin、Wxmq、Wxmp、Wxhp。Wxa、Wxb等位基因的第1内含子5’端剪切位点G/T突变，降低了Wx 基因转录后mRNA 的剪接效率(Blight, Plant Mol Biol,1998,38(3):407-415)，其中IR63、特青的基因型为Wxa，明恢63 的腊质基因型为Wxb；wx等位基因的第2外显子23bp碱基重复插入，导致终止密码子提前出现(Inukai, Genome,2000,43(4):589-596)；Wxop 和Wxhp 等位基因的第4外显子A/G突变，云南软米低直链淀粉含量由Wxhp 基因的遗传控制；Wxmq 等位基因的第4外显子G/A突变导致氨基酸由Asp 变为Gly(Mikami, Euphytica,1999,105(2):91-97; Liu, PlantMol Biol,2009,71(6)609-626)，第5外显子T/C突变，来自日本的软米含Wxmq，如品种关东大194 的直链淀粉含量较低(Sato, Breeding Sci,2002,52(2):131-135)，显示软米的特点；Wxin 等位基因的第6外显子A/C突变，其编码的氨基酸由Tyr 变为Ser(Larkin, MolBreeding,2003,12(4):335-339)，第10外显子的C/T 突变(Bergman．Cereal Chem ,2001,78(3):257-260)。这7个功能位点已被证实与稻米直链淀粉含量变化显著相关。这些等位变异是造成稻米品质差异的主要原因。