[发明专利]纳米化RNAi制剂在PVY防治中的应用在审
| 申请号： | 201910702476.2 | 申请日： | 2019-07-31 |
| 公开（公告）号： | CN110527684A | 公开（公告）日： | 2019-12-03 |
| 发明（设计）人： | 杨金广;许曼琳;刘明宏;王小彦;迟玉成;张霞;王凤龙;李莹;王杰;申莉莉;于静;郭志青 | 申请（专利权）人： | 中国农业科学院烟草研究所;山东省花生研究所;贵州省烟草公司遵义市公司 |
| 主分类号： | C12N15/113 | 分类号： | C12N15/113;C12N15/87;A01N57/16;A01P1/00 |
| 代理公司： | 37256 青岛清泰联信知识产权代理有限公司 | 代理人： | 李祺;张洁<国际申请>=<国际公布>=< |
| 地址： | 266100 山东省青岛市崂山*** | 国省代码： | 山东;37 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 纳米化 病毒防治 防治 蛋白酶 复制增殖 关键作用 基因工程 连接蛋白 纳米材料 衣壳蛋白 基因 基因组 壳聚糖 应用 体内 移动 | ||
1.纳米化RNAi制剂在PVY防治中的应用，其特征在于，所述纳米化RNAi制剂是由dsRNA和壳聚糖纳米材料制成的，所述dsRNA是包括衣壳蛋白CP、辅助成分-蛋白酶HC-Pro和基因组连接蛋白VPg的三个对PVY在植物体内复制增殖移动起到关键作用的蛋白基因制得。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述dsRNA的制备方法，包括以下步骤：
选取经PVY侵染后的植物叶片，提取其总RNA后，通过逆转录过程得到PVY的cDNA；
以所述PVY的cDNA为模板，设计CP、HC-Pro和VPg序列的扩增引物，进行PCR扩增，得到所述三种基因的扩增产物；
以所述扩增产物为模板，体外合成dsRNA。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述dsRNA的浓度为0.8～1.5μg/μl。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述提取总RNA的方法为Trizol抽提法或根据总RNA提取试剂盒的说明书提取得到。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述CP基因的上下游引物序列为SEQ IDNO.1-2所示的DNA序列，HC-Pro基因的上下游引物序列为SEQ ID NO.3-4所示的DNA序列，VPg基因的上下游引物引物序列为SEQ ID NO.5-6所示的DNA序列。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述壳聚糖纳米材料的制备方法是将壳聚糖溶解于1％冰乙酸中，制得壳聚糖纳米材料；所述壳聚糖纳米材料溶液的终浓度为1.5～2.5μg/μl。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述纳米化RNAi制剂是将dsRNA液体缓慢加到所述壳聚糖纳米材料溶液中混匀后制得。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述壳聚糖和dsRNA的质量比是(10～30):1。
9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述纳米化RNAi制剂的使用方法是将成品溶液均匀涂抹或喷施在植物叶片上。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述纳米化RNAi制剂可施用于烟草、番茄、辣椒或马铃薯。
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