[发明专利]一种用于植物基因定点剪切的TALE核酸酶精简骨架构建

说明书

本发明公开了一种用于植物基因剪切的TALE核酸酶精简骨架序列。该骨架N端包含136个氨基酸，C端包含63个氨基酸，中间构建识别特异DNA序列的TALE的重复模块，C端融合有Fok1 Ⅱ型核酸内切酶，在N端和C端插入含有两种不同内切酶的小片段，通过上述两个内切酶可以随意插入TALE的重复模块，构建成能够剪切特异DNA序列TALE核酸酶。利用本TALE核酸酶精简构建八氢番茄红素脱氢酶剪切核酸酶，转化植物后获得白化苗。

技术领域

本发明属于植物生物技术领域，具体地说构建适合植物表达的TALENs 的精简骨架，即N端包含136个氨基酸，C端包含63个氨基酸，中间构建识别特异DNA序列的TALE的重复模块，C端融合有FokI Ⅱ型核酸内切酶，构建成TALE核酸酶能够剪切特异DNA序列。

背景技术

近年来兴起的基因组定点编辑技术包括以下几种人工核酸酶：锌指核酸酶(ZFNs), TALE核酸酶(TALENs), 以及CRISPR/Cas系统。这些人工核酸酶都可以在DNA靶位点产生DNA双链断裂, 它们对基因组定点编辑是通过控制DNA的修复途径实现的。目前主要应用技术有CRISPR/Cas系统和TALENs技术。

2009年，美国爱荷华州立大学植物病理、生物信息学和计算生物学计划系的Moscou等（Moscou，Science, 2009，326(5959): 1501）以及德国马丁·路德大学生物研究所遗传系的Boch等同时在国际著名的自然科学综合类学术期刊《Science》上发表文章（Boch，Science, 2009，326(5959): 1509-1512），研究报道在植物病原菌黄单胞菌（Xanthomonas）上发现了转录激活子样效应因子（Transcription activator-likeeffectors，TALES），TALES可特异性地结合到DNA上并激活基因表达，在该病原菌感染过程中对植物基因进行调控。

随后的研究表明，TALES蛋白的DNA结合域由一串连续排列、数目不同（12-30个不等）、序列高度同源的蛋白结构域模块构成，每个模块大小为33-35个氨基酸。模块的第12位和13位的氨基酸对应识别DNA分子四个碱基中的一个。利用TALE序列模块，可组装成特异结合任意DNA序列的模块化蛋白，从而达到靶向操作内源性基因的目的（Boch and Bonas,Annu Rev Phytopathol, 2010,48: 419-436）。随后，研究人员尝试仿照锌指核酸酶(ZFN)的模式,把TALE中的转录激活结构域(AD)替换成核酸内切酶FokI，从而构成TALE核酸酶(TALENs),对基因组特定靶位点进行定向切割, 从而实现基因打靶。 正如巡航导弹击中军事目标一样，TALEN可特异识别DNA序列并进行切割，从而进行基因修饰或敲除，使基因操作变得异常简单、方便(Cermak,Nucleic Acids Res,2011, 39(12): e82)。

TALENs技术可以对基因组靶位点DNA进行结构性缺失、插入、重组、修复等剪辑，实现基因功能性敲除或激活。该技术发明后，立即在物种改造和基因治疗领域受到高度重视。短短几年时间内，TALENs技术已经成功应用到了动物细胞、植物、酵母、斑马鱼及大、小鼠等各类研究对象，日益成为功能强大的实验室基因编辑工具。2012年，美国爱荷华州立大学遗传发育和细胞生物学系的 Yang Bing 博士及其同事利用 TALENs 技术成功地将水稻感病基因 Os11N3 启动子序列定点切割，使水稻白叶枯病原菌 TAL 效应子 AvrXa7 和 PthXo3失去对 Os11N3 基因启动子靶点序列的识别，从而提高了水稻抗白叶枯病的能力。这是世界第一例通过 TALENs 技术对植物基因组真正实施定点剪辑并获得目标性状改良的植物(Yang and White, Mol Plant Microbe Interact, 2004, 17(11):1192-200)。可以预见,TALENs技术在医学和农业基础和应用领域必将发挥越来越有广阔的应用前景, 并且产生无可估量的深远影响。