[发明专利]一种木材靶向细胞DNA提取方法

权利要求书

1.一种木材靶向细胞DNA提取方法，其特征在于：去除木材表面外源污染，利用细胞化学方法并结合显微技术定位和分离富集DNA的靶向细胞，并加入DNA裂解液、除杂、沉淀、溶解、纯化和巢式PCR扩增高效提取木材DNA；包括以下步骤：

(1)从木材组织中切取体积为V的木材样品，去除木材表面外源污染；

(2)将步骤(1)得到的木材样品切取木材径切面切片，使用细胞化学方法并结合显微技术检测木材细胞中DNA的含量与分布，确定富集DNA的靶向细胞；木材切片厚度与木材靶向细胞弦向直径大小相同；

(3)将步骤(2)得到的木材径切面切片置于载玻片上，使用1.0-5.0mMDAPI溶液将木材径切面切片染色10-60min后，再用0.1-0.5M磷酸盐缓冲液洗涤3次，通过荧光显微技术观测DNA分布位置，同时确定富集DNA的靶向细胞，在倒置显微镜下利用无菌解剖刀分离木材靶向细胞，收集于离心管中；所述的靶向细胞为薄壁细胞；

(4)将步骤(3)得到的装有木材靶向细胞容器中加入DNA裂解液，混匀后置于水浴加热，将容器冷却，再加入除杂缓冲液，混匀后离心；

(5)将步骤(4)得到的上清液转移至新容器中，向新容器中加入DNA沉淀缓冲液，用移液器混匀后离心；

(6)将步骤(5)中得到的上清液弃掉，向新容器中加入清洗缓冲液，离心清洗；

(7)向步骤(6)得到的沉淀有DNA的新容器中加入双蒸水，静置溶解，得到DNA提取液；

(8)将步骤(7)得到的DNA作为模板，加入到反应体系中进行PCR扩增反应，得到DNA目的片段；

步骤(4)中，加入4.5ml DNA裂解液充分震荡混匀，55℃裂解5h；冷却后按照体积比加入1.0倍体积的除杂缓冲液，混匀5-20min后离心，离心速率为5000-15000rpm，离心时间为5-15min；

所述的DNA裂解液为：55mM CTAB、100mM Tris-HCl、1.4M NaCl、20mM EDTA、1％(w/v)BoricAcid和3％(w/v)PVP-40；然后加入20M蛋白酶K和1M DTT；体积比为30:5:1；

步骤(5)中DNA沉淀缓冲液包括异丙醇、醋酸钠和糖原，体积比为500:200:2；步骤(5)中向新离心管中按照体积比加入0.5倍体积的DNA沉淀缓冲液，混匀于2-6℃静置后离心，离心速率为5000-15000rpm，离心时间为1-15min；步骤(8)中的PCR扩增反应体系包括：2U DNA聚合酶、2.0mM MgCl₂、200μM单一dNTP、0.1-5.0μM单一引物、pH7.0的0.1mg/ml牛血清白蛋白和10ng模板DNA。

2.如权利要求1所述的木材靶向细胞DNA提取方法，其特征在于：所述体积为V为7～13mm×7～13mm×7～13mm；所述木材径切面切片是使用滑走式切片机切取；所述的容器为离心管；所述的步骤(4)中混匀是涡旋振荡混匀；所述的水浴加热是置于摇床台上水浴加热；所述去除木材表面外源污染包括表面切除、和/或消毒处理、和/或激光辐射净化；所述的步骤(2)中细胞化学方法检测木材细胞中DNA的含量与分布。

3.如权利要求1至2任一所述的木材靶向细胞DNA提取方法，其特征在于：去除木材表面外源污染包括使用激光辐射扫描木材样品表面，然后将木材样品置于次氯酸钠浸泡，然后使用解剖刀将木材样品外表面切除；

所述的步骤(6)中离心速率为5000-15000rpm，离心时间为1-15min；

所述的步骤(7)中静置溶解是指在2-6℃环境下静置溶解。

4.根据权利要求3所述的木材靶向细胞DNA提取方法，其特征在于：所述的激光辐射，为100-1200W，10-50Hz；去除木材表面外源污染的方法包括：使用激光辐射扫描木材样品表面，扫描速度1-3cm/s，2个循环，然后将木材样品置于1％-10％次氯酸钠浸泡10-60min，然后使用无菌的解剖刀将木材样品外表面切除1-4mm；

步骤(5)低温为4℃；所述的步骤(7)中静置溶解是指在4℃环境下静置溶解。