[发明专利]合成呋喃酮及其衍生物葡萄糖苷的糖基转移酶突变体蛋白

说明书

本发明公开了一种合成呋喃酮及其衍生物葡萄糖苷的糖基转移酶突变体蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。本发明通过定点突变技术，发现一个关键氨基酸位点，可以明显提高呋喃酮糖苷的合成能力及改变糖基转移酶对糖的选择性。为呋喃酮及其衍生物糖苷的高效生产，提供了一种生物合成的有效方法。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种合成呋喃酮及其衍生物葡萄糖苷的糖基转移酶突变体蛋白。

背景技术

呋喃酮(4-羟基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮,Furaneol,DMHF)，又称菠萝酮或草莓酮，分子量为128.13，是一种白色至浅黄色结晶体或粉末状固体。熔点为78-80℃，微溶于水，易溶于乙醇等有机试剂。

呋喃酮具有强烈的焦糖香气，同时具有浓郁的水果香味，稀释又具有覆盆子香味。自从1965年J.O.Rodin等人在菠萝汁的乙醚萃取液中首次鉴定出呋喃酮以来，先后在菠萝、草莓、番茄、葡萄、茶等天然产物中鉴定了呋喃酮的存在。呋喃酮由于其显著的增香修饰效果和持久的香味，被认为是甜味香料的重要原料和优良的增香剂，同时呋喃酮也是美国食用香料制造者协会(FEMA)和欧洲理事会(COE)共同认可的安全食用香料。呋喃酮被广泛用于食品、饮料以及日化产品中，在面包、饼干、糖果、巧克力、肉制品、奶制品、软饮料、葡萄酒、香烟、口香糖等食用香精的调配中，具有显著的增香、柔和及清新作用；在牙膏和香烟中，具有明显的除辣味、掩盖杂气、改善味道的功效；在日用香制品、化妆品及药物中，呋喃酮可以用来掩盖某些令人不愉快的味道；另外呋喃酮在医学上，还可以用来预防和治疗白内障。

人们先后在草莓和葡萄中发现了呋喃酮葡萄糖苷，并对呋喃酮在草莓和葡萄中的生理代谢进行了解析。从那以后，人们认为呋喃酮在植物中以呋喃酮葡萄糖苷的形式存在。相比游离态香气物质，香气糖苷性质更稳定，水溶性更强，且具有多种重要的生物学功能，在化妆品、食品和药物开发领域具有巨大的商业价值。香气糖苷主要由糖基转移酶(UGT)通过糖基化反应催化合成。此外，糖基化是植物次生代谢最为重要的修饰反应之一，在调节植物细胞代谢平衡、解除外源毒素毒性、维持植物正常生长发育等方面具有重要作用，同时也可以通过代谢工程途径改善植物的香气成分。

目前，香气糖苷的合成主要通过化学和生物两种手段实现。化学合成虽然合成方法多种多样，但总体来看，产率偏低，有的方法甚至需要重金属催化剂。生物合成由于使用酶或工程菌在常温下催化，对环境无危害，且对位点选择性较强，产物单一，安全可靠，近年来，备受人们喜爱。但目前多种香气糖苷的生物合成方法还不成熟，关于呋喃酮糖苷的相关研究更少，目前关于提高呋喃酮糖苷生物合成的方法，并没有研究和报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题为：如何提供一种合成呋喃酮及其衍生物葡萄糖苷的糖基转移酶突变体蛋白，解决呋喃酮及其衍生物葡萄糖苷的生物合成效率低的难题。

本发明的技术方案为：

一种合成呋喃酮及其衍生物葡萄糖苷的糖基转移酶突变体蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

编码SEQ ID No.3所示糖基转移酶突变体的核苷酸，优选地，其碱基序列如SEQ IDNo.4所示。

表达载体，其含有上述所述的核苷酸片段。

基因工程菌，其含上述所述的表达载体。

本发明的糖基转移酶突变体蛋白或所述的核苷酸或所述的表达载体或所述的基因工程菌在呋喃酮及其衍生物糖苷制备上的应用。

糖基转移酶突变体蛋白的制备方法，包括如下步骤：

(1)以包含SEQ ID No.1氨基酸序列的质粒为模板，以SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的核苷酸序列为引物进行PCR，得到SEQ ID No.4所示的突变基因；

(2)将步骤(1)得到的突变基因进行原核表达；