[发明专利]一种提高转基因细胞重组效率的组合物及方法

权利要求书

1.一种利用CRISPR-Cas9系统制备点突变动物的方法，包括：

1)将Cas9-D10A mRNA和Donor oligo的混合物直接注入单细胞受精卵的一细胞的胞浆内；

2)待受精卵发育成二细胞，把预混好的sgRNA混合物直接注入二细胞中；

3)注射后将二细胞期的受精卵放置在培养基内培养；

4)将培养后的细胞移植到雌体内，产仔后得到点突变动物；

其中，培养基为添加有SCR7的KSOM培养基，SCR7在KSOM培养基中的终浓度为1.5～4.5μM；

所述的点突变动物为Fars2基因点突变鼠，突变点为D142Y；所述Donor oligo的序列为AGTGGTCACCACCTGGCAGAACTTCGATAGCCTGCTAATCCCAGCTGACCACCCCAGCAGGAAGAAGGGGTACAACTATTACTTGAATCGGGGACACATGCTGAGAGCACACACATCAGCACATCAGTGGGACTTGCTGCATG；

所述sgRNA的序列为：

sgRNA1：

Pair1-g1-F：caccgTTGTCCCCCTTCTTCCTGCT

Pair1-g1-R：aaacAGCAGGAAGAAGGGGGACAAc

和sgRNA2：

Pair1-g2-F：caccgGGACAACTATTACTTGAATC

Pair1-g2-R：aaacGATTCAAGTAATAGTTGTCCc；

所述方法不用于疾病的诊断和治疗。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述突变点为GAC＞TAC的单核苷酸突变。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述Cas9-D10A mRNA和Donor oligo的混合物中，Cas9-D10A mRNA和Donor oligo的终浓度均为40ng/μL～120ng/μL。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述Cas9-D10A mRNA和Donor oligo的质量比为1：1。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述sgRNA混合物中，sgRNA1和sgRNA2的终浓度均为20ng/μL～60ng/μL。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述sgRNA1和sgRNA2的质量比为1：1。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：将二细胞期的受精卵放置在培养基内培养的时间为12～48小时。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述时间为24小时。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述动物为大鼠SD、LongEvans、Wistar、F344；小鼠C57BL/6N、C57BL/6J、FVB。