[发明专利]一种高血压治疗药物相关基因的高通量测序方法及其应用

权利要求书

1.一种高血压治疗药物相关基因的高通量测序方法，具体包括如下步骤：

(1)根据高血压治疗药物相关基因，设计基因扩增引物组合；

所述基因扩增引物组合，各上下游引物序列的5’端含有一段共有序列，用于接头引物扩增；所述上下游引物的3’端为结合到目标区域的特异性序列；

(2)待测样本基因组DNA提取与浓度检测；

(3)高血压治疗药物相关基因多重PCR扩增反应及产物纯化；

(4)将步骤(3)产物作为模板，进行接头序列PCR扩增反应及产物纯化；

(5)文库质控：采用Qubit检测步骤(4)产物文库浓度，琼脂糖凝胶电泳检测步骤(4)产物文库片段大小；

(6)高通量测序：使用高通量测序仪器对文库进行高通量测序。

2.根据权利要求1所述的高血压治疗药物相关基因的高通量测序方法，其特征在于，所述高血压治疗药物相关基因，具体为：ABCB1、ABCC4、ACE、ADD1、ADRA1A、ADRB1、ADRB2、AGT、AGTR1、APOB、BDKRB2、CACNA1C、CAMK1D、CYP11B2、CYP2C9、CYP2D6、CYP3A4、GNB3、GPR83、KCNH2、NEDD4L、NOS3、NPHS1、NR3C2、PLCD3、PRKCA、PROX1、PTGS2、PTPRD、SLC14A2、SLCO1B1、UGT1A1、YEATS4；所述基因扩增引物组合为39对引物，具体为：

3.根据权利要求l所述的高血压治疗药物相关基因的高通量测序方法，其特征在于，所述步骤(2)中的待测样本为唾液样本、口腔拭子或血液样本；基因组DNA提取，使用MagMAX^TMDNA Multi-Sample Kit，按照试剂盒说明书操作步骤进行DNA提取；DNA浓度检测方法为：将获得的基因组DNA使用Qubit进行检测，Qubit定量样品浓度≥2ng/μL；提取的DNA总量≥100ng。

4.根据权利要求1所述的高血压治疗药物相关基因的高通量测序方法，其特征在于：所述步骤(3)中高血压治疗药物相关基因多重PCR反应的体系包括引物混合物8μL，人基因组DNA 5μL，NEBNext Ultra II Q5预混液(New England Biolabs)15μL，无核酸酶水2μL；所述步骤(3)中高血压治疗药物相关基因多重PCR扩增反应的扩增程序为：98℃预变性3分钟，1个循环；98℃变性20秒，59℃退火延伸4分钟，共18～23个循环；72℃彻底延伸10分钟，1个循环。

5.根据权利要求1所述的高血压治疗药物相关基因的高通量测序方法，其特征在于：

所述步骤(3)中的产物纯化，采用核酸纯化磁珠进行纯化，具体包括下述步骤：

1)向30μL PCR产物中，加入15μL室温平衡后的核酸纯化磁珠，用移液器吸打混匀数次；

2)室温孵育2～5分钟后，将EP管置于磁力架上吸附核酸纯化磁珠，直至溶液澄清为止；

3)转移上清至新的EP管，向管内加入18μL磁珠，用移液器吸打混匀数次；

4)室温孵育2～5分钟后，将PCR管置于磁力架上吸附磁珠，直至溶液澄清为止，移除上清，PCR管继续放置在磁力架上；

5)用100μL80％新鲜配置乙醇，用磁力架反复在不同的两面来回吸附磁珠，以充分悬浮磁珠洗涤；

6)用磁力架吸附磁珠，直至溶液澄清为止。用移液器尽可能移除剩余的乙醇溶液，室温静置2～5分钟，直至乙醇完全挥发；

所述步骤(4)中的产物纯化，采用核酸纯化磁珠进行纯化，具体包括下述步骤：

1)向30μL PCR产物中，加入24μL室温平衡后的核酸纯化磁珠，用移液器吸打混匀数次；

2)室温孵育2～5分钟后，将EP管置于磁力架上吸附磁珠，直至溶液澄清为止，移除上清，PCR管继续放置在磁力架上；

3)用100μL 80％新鲜配置乙醇，用磁力架反复在不同的两面来回吸附磁珠，以充分悬浮磁珠洗涤；

4)用磁力架吸附磁珠，直至溶液澄清为止。用移液器尽可能移除剩余的乙醇溶液，室温静置2～5分钟，直至乙醇完全挥发；

5)加入20uL无核酸酶水或TE溶液洗脱DNA。