[发明专利]一种LMH细胞体外分离鉴定鸭圆环病毒的方法

说明书

本发明公开了一种LMH细胞体外分离鉴定鸭圆环病毒的方法，包括以下步骤：（1）鸭圆环病料；（2）鸭圆环病料处理；（3）LMH细胞：细胞复苏后，传代3‑5代后准备接毒；（4）接毒：细胞传代贴壁后5‑6小时进行接毒；（5）添加D‑氨基葡萄糖和胰酶；（6）病毒培养与收获：接毒后继续培养至72小时进行收获，反复冻融3次，离心收获上清液；（7）病毒鉴定：采用PCR方式对收获每代鸭圆环病毒和阳性病料进行鉴定；（8）鉴定阳性样品送检测序。由于采用了上述技术方案，本发明具有以下有益效果：本发明首次实现了鸭圆环病毒体外细胞传代培养，初步解决了目前鸭圆环病毒不能体外培养的问题；对于更深入了解鸭圆环病毒致病机理奠定了基础。

技术领域

本发明涉及兽医学技术领域，具体说是一种LMH细胞体外分离鉴定鸭圆环病毒的方法。

背景技术

鸭圆环病毒（Duck circivirus，DuCV）属于圆环病毒科，是无囊膜、二十面体对称的病毒，其基因组为单股环状DNA，主要是侵害宿主的免疫系统，造成免疫功能低下，进而易引发二重甚至多重感染，造成巨大的经济损失。目前，动物圆环病毒仅有鸡传染性贫血病病毒(CIAV)和猪圆环病毒(PCV)在体外增殖的研究比较深入，而DuCV由于没有体外增殖的方法，所以研究进展缓慢。

我国是养鸭大国，出栏量和消费量位居世界第一。据我国水禽产业体系数据，我国肉鸭最高峰年出栏量约为40亿只。近些年来由于养殖密度较大，疫病防控形式严峻，疫病呈多发态势。鸭圆环病毒病的发病率每年都处于上升趋势，给全国的肉鸭养殖带来巨大经济损失的同时，使得药物使用量大幅度增加，严重危害着食品安全。根据产业发展需求，实现体外鸭圆环病毒培养对深入研究鸭圆环病毒致病机理及疫苗制造具有极其重要作用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种LMH细胞体外分离鉴定鸭圆环病毒的方法。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：一种LMH细胞体外分离鉴定鸭圆环病毒的方法，包括以下步骤：

（1）鸭圆环病料：经PCR鉴定为阳性；

（2）鸭圆环病料处理：取适量脾脏，加入5倍体积PBS进行研磨，研磨后经0.22微米滤器进行无菌过滤；

（3）LMH细胞：细胞复苏后，传代3-5代后准备接毒；

（4）接毒：细胞传代贴壁后5-6小时进行接毒；

（5）添加D-氨基葡萄糖和胰酶；

（6）病毒培养与收获：接毒后继续培养至72小时进行收获，反复冻融3次，离心收获上清液；

（7）病毒鉴定：采用PCR方式对收获每代鸭圆环病毒和阳性病料进行鉴定；

（8）鉴定阳性样品送检测序。

作为优选，所述步骤（4）中，按照LMH细胞：病毒液为1：10-1：50的培养体积量接毒。

作为优选，所述步骤（5）中，按300mmol/L的浓度添加D-氨基葡萄糖。

作为优选，所述步骤（5）中，按终浓度为2-5ug/ml的量添加胰酶。

作为优选，所述步骤（7）中，PCR鉴别引物为：上游引物为：AGATTACGTTCATGTTTTAG，下游引物为：TCAAAGGTAGGGTTATTA。

由于采用了上述技术方案，本发明具有以下有益效果：本发明首次实现了鸭圆环病毒体外细胞传代培养，初步解决了目前鸭圆环病毒不能体外培养的问题；对于更深入了解鸭圆环病毒致病机理奠定了基础。

具体实施方式

附图说明：

图1为实施例一中PCR鸭圆环病毒基因序列琼脂糖凝胶电泳结果。