[发明专利]以木质素为原料生产粘糠酸的基因工程菌

权利要求书

1. 以木质素为原料生产粘糠酸的基因工程菌的构建方法，其特征在于，为将红球菌Rhodococcus opacus PD630中的粘糠酸环化异构酶、邻苯二酚2,3双加氧酶基因和原儿茶酸3,4双加氧酶基因三基因敲除，并插入原儿茶酸脱羧酶基因和原儿茶酸脱羧酶辅酶基因的基因工程菌，所述的原儿茶酸脱羧酶基因的Genbank登录号为 ADF6149，原儿茶酸脱羧酶辅酶基因的Genbank:登录号为ADF63617，所述的基因工程菌为R. opacus PD630-MA4，通过以下步骤构建：

步骤1，用于敲除基因的pk18mob-pheS骨架质粒的构建：合成引物PCR扩增红球菌基因组中包含GenBank：AHK32253.1的苯丙氨酰-tRNA合成酶基因及其自身启动子的核苷酸片段，其中上游引物为SEQ ID NO:1：tacccggggatcctctagaTGCGGTCCTCGACAGCATCAGCG；下游引物为SEQ ID NO:2：aacgacggccagtgccaagcttATTGCGCTACTCGCACGTCTGC，将含有自身启动子序列的苯丙氨酰-tRNA合成酶基因和pk18mob质粒连接，获得pk18mob-pheS骨架质粒；

步骤2，苯丙氨酰-tRNA转运蛋白基因突变体的自杀质粒载体pK18mob-pheS*的构建：采用反向PCR技术将pk18mob-pheS骨架质粒中的苯丙氨酰-tRNA合成酶基因中编码329位丙氨酸的核苷酸突变为编码甘氨酸的核苷酸，其特异性引物：上游SEQ ID NO:3：GTACACCGGGTTCGGGTTCGGCATGGG；下游SEQ ID NO:4：CCCATGCCGAACCCGAACCCGGTGTAC，然后限制性内切酶Dpn I酶切后转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，获得自杀质粒载体pK18mob-pheS*；

步骤3，粘糠酸环化异构酶基因的敲除：采用重叠PCR方法，将红球菌基因组中的粘糠酸环化异构酶基因两端同源臂拼接后克隆到自杀质粒载体pK18mob-pheS*上，特异性引物：SEQ ID NO:5：acgaattcgagctcggtaccTACCCCAGCTTCTGCAGGGTG；SEQ ID NO:6：gtgccatcgggtggtgtgctccCGGATCACTTTCTCTACGGGTGG；SEQ ID NO:7：ccacccgtagagaaagtgatccgGGAGCACACCACCCGATGGCAC；SEQ ID NO:8：gcctgcaggtcgactctagaCACCCAGCTGGCCATCTGCG，获得自杀型质粒 pK18mob-pheS*-MC，再转入到红球菌Rhodococcus opacus PD630中，获得敲除粘糠酸环化异构酶基因的菌株R.-MA1；

步骤4，邻苯二酚2,3双加氧酶基因的敲除：采用重叠PCR方法，将红球菌基因组中的邻苯二酚2,3双加氧酶基因两端同源臂拼接后克隆到自杀质粒载体pK18mob-pheS*上，特异性引物如下：SEQ ID NO:9：acgaattcgagctcggtaccGGCCAACGGCGTGAAGCCGGC，SEQ ID NO:10：caggcccccacaccgaggacaactcGACACGGGACGCACCGTCGAAAGGGAC，SEQ ID NO:11：gtccctttcgacggtgcgtcccgtgtcGAGTTGTCCTCGGTGTGGGGGCCTG，SEQ ID NO:12：tgtcgaggaccgcatctagaGAGCGGGACGACCTCCTGCTGCG，获得自杀型质粒pK18mob-pheS*-C23D，再转入到R.-MA1中，获得敲除粘糠酸环化异构酶基因和邻苯二酚2,3双加氧酶基因的菌株R.-MA2；

步骤5，原儿茶酸3,4双加氧酶基因的敲除：采用重叠PCR方法，将红球菌基因组中的原儿茶酸3,4双加氧酶基因两端同源臂拼接后克隆到自杀质粒载体pK18mob-pheS*上，特异性引物如下：SEQ ID NO:13：acgaattcgagctcggtaccCGGCCCGACCCCGAGGATGC；SEQ ID NO:14：gcgcgacacctttctgggttgtgaccgaGGAAAAAGATCCTCACGTTCTCGATGTGAACAGTC；SEQ ID NO:15：gactgttcacatcgagaacgtgaggatctttttccTCGGTCACAACCCAGAAAGGTGTCGCGC；SEQ ID NO:16：gcctgcaggtcgactctagaGCGCGACGGCTCCGCCGG，获得自杀型质粒pK18mob-pheS*-PD，再转入到R.-MA2中，获得敲除粘糠酸环化异构酶基因、邻苯二酚2,3双加氧酶基因和原儿茶酸3,4双加氧酶基因的菌株R.-MA3；

步骤6，原儿茶酸脱羧酶和其辅酶基因的插入：采用重叠PCR方法，将原儿茶酸脱羧酶基因、辅酶基因连接后插入到pK18mob-pheS*中并生成pK18mob-pheS*-aroy-ecdB基因插入型质粒，再转入到R.-MA3中获得敲除粘糠酸环化异构酶基因、邻苯二酚2,3双加氧酶基因和原儿茶酸3,4双加氧酶基因三基因敲除并插入原儿茶酸脱羧酶和其辅酶基因的菌株R. opacus PD630-MA4。