[发明专利]以含酚类化合物为原料生产粘糠酸的基因工程菌

权利要求书

1.以含酚类化合物为原料生产粘糠酸的基因工程菌的构建方法，其特征在于，为将红球菌中的粘糠酸环化异构酶基因和邻苯二酚2,3双加氧酶基因双敲除得到的基因工程菌，通过以下方法构建：

步骤1，用于敲除基因的pk18mob-pheS骨架质粒的构建：合成引物PCR扩增红球菌基因组中包含GenBank：AHK32253.1的苯丙氨酰-tRNA合成酶基因及其自身启动子的核苷酸片段，其中上游引物为SEQ ID NO:1：tacccggggatcctctagaTGCGGTCCTCGACAGCATCAGCG，下游引物为SEQ ID NO:2：aacgacggccagtgccaagcttATTGCGCTACTCGCACGTCTGC，将含有自身启动子序列的苯丙氨酰-tRNA合成酶基因和pk18mob质粒进行连接，获得pk18mob-pheS骨架质粒；

步骤2，苯丙氨酰-tRNA转运蛋白基因突变体的自杀质粒载体pK18mob-pheS*的构建：采用反向PCR技术将pk18mob-pheS骨架质粒中的苯丙氨酰-tRNA合成酶基因中编码329位丙氨酸的核苷酸突变为编码甘氨酸的核苷酸，其特异性引物：上游SEQ ID NO:3：GTACACCGGGTTCGGGTTCGGCATGGG，下游SEQ ID NO:4：CCCATGCCGAACCCGAACCCGGTGTAC，然后限制性内切酶Dpn I酶切后转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，获得自杀质粒载体pK18mob-pheS*；

步骤3，粘糠酸环化异构酶基因的敲除：采用重叠PCR方法，将红球菌基因组中的粘糠酸环化异构酶基因两端同源臂拼接后克隆到自杀质粒载体pK18mob-pheS*上，特异性引物：SEQ ID NO:5：acgaattcgagctcggtaccTACCCCAGCTTCTGCAGGGTG，SEQ ID NO:6：gtgccatcgggtggtgtgctccCGGATCACTTTCTCTACGGGTGG，SEQ ID NO:7：ccacccgtagagaaagtgatccgGGAGCACACCACCCGATGGCAC，SEQ ID NO:8：gcctgcaggtcgactctagaCACCCAGCTGGCCATCTGCG，获得自杀型质粒 pK18mob-pheS*-MC，再转入到红球菌Rhodococcus opacus PD630中，获得敲除粘糠酸环化异构酶基因的菌株R.-MA1；

步骤4，邻苯二酚2,3双加氧酶基因的敲除：采用重叠PCR方法，将红球菌基因组中的邻苯二酚2,3双加氧酶基因两端同源臂拼接后克隆到自杀质粒载体pK18mob-pheS*上，特异性引物如下：SEQ ID NO:9：acgaattcgagctcggtaccGGCCAACGGCGTGAAGCCGGC，SEQ ID NO:10：caggcccccacaccgaggacaactcGACACGGGACGCACCGTCGAAAGGGAC，SEQ ID NO:11：gtccctttcgacggtgcgtcccgtgtcGAGTTGTCCTCGGTGTGGGGGCCTG，SEQ ID NO:12：tgtcgaggaccgcatctagaGAGCGGGACGACCTCCTGCTGCG，获得自杀型质粒pK18mob-pheS*-C23D，再转入到R.-MA1中，获得敲除粘糠酸环化异构酶基因和邻苯二酚2,3双加氧酶基因的菌株R. opacus PD630-MA2。

2.根据权利要求1所述的构建方法在含酚类化合物废水处理中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，应用方法为将基因工程菌接种到含酚类化合物废水中，曝气处理，将含酚类化合物转化为粘糠酸。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，以单一菌株或混合菌株将基因工程菌接种到含酚类化合物废水中。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，以游离形式或固定化形式将基因工程菌接种于含酚类物质的废水中。