[发明专利]一种表达瑞替普酶rPA的细胞株及方法

说明书

本发明属于生物制药领域，具体涉及一种人源细胞表达瑞替普酶的方法细胞株。该方法具体步骤为：基因合成含有分泌信号的编码瑞替普酶的cDNA序列并插入慢病毒表达载体，构建可以分泌表达瑞替普酶的慢病毒载体，并包装慢病毒颗粒，然后以此慢病毒颗粒感染人源细胞293F，以慢病毒载体内携带的嘌呤霉素抗性筛选高拷贝、稳定表达瑞替普酶的单克隆细胞株，测试瑞替普酶表达含量及酶活性，验证建立的表达方法。本发明的优势在于：本方法建立的瑞替普酶表达细胞株是人源293F细胞，不含有致热源内毒素；并且表达细胞株是悬浮、稳定表达瑞替普酶，易于规模化放大，同时是分泌表达瑞替普酶，杂质少，易于纯化。

技术领域

本发明涉及生物制药领域，具体涉及一种以人源细胞分泌表达瑞替普酶rPA的新方法。

背景技术

当前，血栓栓塞是严重危害人类健康的常见心血管疾病，给病患个人、家庭及社会带来沉重负担。溶栓治疗是目前治疗血栓栓塞疾病的最有效手段。而瑞替普酶rPA是临床应用较好的第三代溶栓药物，rPA是人组织纤溶酶原激活剂tPA的缺失突变体，是一个单链非糖基化蛋白，分子量为39kDa，含9对二硫键。临床上，rPA更容易作用于血栓内部，纤溶效果强、起效迅速。

鉴于栓塞病人的逐年增长，临床上对瑞替普酶的需求量非常高。然而当前制备瑞替普酶的工艺主要是以大肠杆菌瞬时表达。该工艺生产的瑞替普酶多以包涵体形式存在，包涵体没有生物学活性，必须经复性才有活性。然而包涵体复性损失量大，并且分子不均一。此外大肠杆菌表达产物常混有内毒素等致热源物质，临床使用需要特定工序清除致热源。另外有应用酵母、哺乳动物细胞生产瑞替普酶，成本高、周期长且得率较低。

本发明采用慢病毒载体将包含分泌信号的瑞替普酶编码基因序列整合至人源细胞293F中，筛选可稳定分泌表达瑞替普酶的细胞株，由此得到的瑞替普酶可溶性表达、不含内毒素，且分泌表达简化后续纯化工艺，真正做到一步纯化，活性鉴定也表明以此方法制备的瑞替普酶具有较好生物学活性。

发明内容

在一个方面，本发明提供了一种表达瑞替普酶rPA的方法，包括如下步骤：将包含编码瑞替普酶基因的慢病毒颗粒感染宿主细胞；培养所述宿主细胞用于表达瑞替普酶；分离得到所述瑞替普酶。

在一个方面，所述宿主细胞为人源细胞。

在一个或多个实施方式中，所述人源细胞为293细胞，优选的，为293F细胞。

在一个实施方式中，所述慢病毒颗粒由plenti-rPA-puro质粒包装得到。

在一个或多个实施方式中，所述质粒携带分泌信号及编码瑞替普酶的cDNA序列。

在一个实施方式中，所述cDNA序列为：SEQ.ID No.2。

在一个实施方式中，其中，所述瑞替普酶的氨基酸序列为：SEQ.ID No.1。

在一个方面，本发明还提供了一种稳定高效表达瑞替普酶rPA的细胞株，由包含编码瑞替普酶基因的慢病毒颗粒感染宿主细胞得到，所述宿主细胞为人源细胞，优选的为293细胞，更优选的，为293F细胞。

在一个实施方式中，所述瑞替普酶的氨基酸序列为：SEQ.ID No.1。

在一个实施方式中，所述慢病毒颗粒由plenti-rPA-puro质粒包装得到。

在一个或多个实施方式中，所述质粒携带分泌信号及编码瑞替普酶的cDNA序列。

在一个实施方式中，所述cDNA序列为：SEQ.ID No.2。

在另一个方面，本发明还提供了一种表达瑞替普酶rPA的方法，包括如下步骤：将慢病毒颗粒lenti-rPA-puro感染人源胚胎肾细胞293F，筛选得到高抗性的293F细胞株；筛选表达瑞替普酶的高抗性的单克隆细胞株293F-rPA；检测瑞替普酶表达量；验证表达高浓度且高活性rPA的单克隆细胞株。