[发明专利]一种提高河流型水牛体外受精胚胎发育率的方法

权利要求书

1.一种提高河流型水牛体外受精胚胎发育率的成熟培养液，其特征在于，所述成熟培养液包括质量百分数为1%-4%的卵泡液；

所述卵泡液为经过氨基酸鳌合处理的卵泡液；

所述氨基酸鳌合处理的方法为：将半胱氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、赖氨酸、色氨酸和甘氨酸溶解于TCM199溶液中，使半胱氨酸的终浓度为500-700µmol/L、甲硫氨酸的终浓度为300-500µmol/L、丙氨酸的终浓度为100-300µmol/L、赖氨酸的终浓度为100-300µmol/L、色氨酸的终浓度为50-100µmol/L、甘氨酸的终浓度为50-150µmol/L；混匀后按照质量比为1:1与直接获取的卵泡液混合，在39℃条件下振荡培养；

所述成熟培养液包括用于屠宰场采卵体外培养的成熟液A或用于活体采卵体外培养的成熟液B；

所述成熟液A的制备方法如下：取50 mL的基础液然后向CM基础液中添加200 µL 的卵泡刺激素-促黄体生成素储存液，45 µL 的雌二醇储存液，100 µL 的EGF液，50 µL 的半胱胺储存液，再添加卵泡液，使卵泡液的终浓度为1%-4%；

所述CM基础液的配制方法如下：

（1）配制Cm-Stock溶液：称取2.45～3.65g的 TCM199，0.18～0.30g 的NaHCO₃，1.0～2.0mg 的丙酮酸钠，35～45 µL 百分含量为70%的乳酸钠， 18～22 mg的青霉素，17～27 mg的链霉素，9～13 mg的酚红；并将上述成分溶解于200 mL的生理盐水中，混合均匀得到所述Cm-Stock溶液；

（2）制备CM基础液：将15mL-25mL的胎牛血清溶解于50 mL的步骤（1）Cm-Stock溶液中得到CM基础液；

所述卵泡刺激素-促黄体生成素储存液的配制方法如下：取120～150 ug的卵泡刺激素溶解于10 mL生理盐水得到卵泡雌激素溶液，再称取2.11～3.04mg的促黄体生成素溶解于上述的卵泡刺激素溶液中混匀后，分装成10 µL/管后，在-20℃保存得到卵泡刺激素-促黄体生成素储存液；

所述雌二醇储存液的配制方法如下：取2.01～2.43 mg的雌二醇溶解于1 mL的乙醇混匀后，分装成10 µL/管，在-20℃保存得到雌二醇储存液；

所述EGF液的配制方法如下：用蒸馏水将表皮细胞生长因子配制成溶质含量为10～18ng/mL的溶液得到EGF液；

所述半胱胺储存液的配制方法如下：称取7.0～7.5 mg的半胱胺溶解于10 mL 步骤（2）的CM基础液中，分装为100 µL每管，在-20℃保存得到半胱胺储存液；

所述成熟液B由如下成分组成：8%的胎牛血清、10 µg/mL 的卵泡刺激素、15 µg/mL 促黄体生成素、5 µg/mL的雌二醇、0.9 mmoL/L的丙酮酸钠、100µmol/L 的半胱氨酸、35 ng/mL的上表皮生长因子、1%-4%的卵泡液、余量为TCM199溶液。

2.一种利用权利要求1所述 成熟培养液进行体外培养的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

（1）屠宰场采卵体外培养：收集水牛卵巢，去除卵巢多余组织，用含双抗的生理盐水清洗2-3遍，用注射器吸取卵泡，在体视镜下选取胞质均匀、胞外有3层以上颗粒细胞的卵母细胞，洗涤2～3次，置于成熟液A中，在39℃、5% CO₂饱和空气湿度培养箱中培养；培养22-24h后将卵母细胞周围的卵丘细胞吹掉，然后用新的成熟液A洗涤两遍后悬浮，制成微滴后覆盖石蜡，在39℃、5% CO₂饱和空气湿度培养箱中培养；将水牛精子孵化后与卵母细胞进行受精、体外胚胎培养；记录各胚胎发育情况；收集发育至第7d的囊胚在显微镜下观察记录囊胚细胞总数；

（2）活体采卵体外培养：对活体水牛进行活体采卵，收集卵母细胞，在体视镜下挑选胞质均匀并包裹一层以上卵丘细胞的COCs，在含5％的胎牛血清和20 mmol/L Hepes的TCMl99液中洗2次，再用成熟液B清洗1次，转入50µL/滴的成熟液B中，在39℃、5％CO₂，最大相对湿度的培养箱中成熟培养22～24 h；培养后与孵化后的水牛精子进行受精、体外胚胎培养、记录各胚胎发育情况；收集发育至第7d的囊胚在显微镜下观察记录囊胚细胞总数。