[发明专利]一种AEP环化酶在毕赤酵母中的表达方法及其应用

说明书

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种AEP环化酶在毕赤酵母中的表达方法及其应用。本发明通过在在毕赤酵母中进行表达，通过基因串联的方法使AEP环化酶基因串联拷贝数最高达到了5拷贝，当基因拷贝数达到3时AEP环化酶表达量最高，达到0.89±0.03mg/mL。本发明采用一种新的方式验证AEP环化酶的环化能力，通过构建一种串联底物，选取能够较好的在SDS‑PAGE中观察到并且具备环化的可能性的蛋白为底物，并构建包含TEV蛋白酶的底物序列的串联底物，根据蛋白酶切割后底物大小的变化或者条带数量来鉴定是否环化，操作简单、方便，实用性强。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种AEP环化酶在毕赤酵母中的表达方法及其应用。

背景技术

天冬酰胺内切酶(AEPs)是一类可催化短肽形成环化肽的关键酶，在植物体内分布广泛，其催化形成的大环寡肽具有一个环状主链和一个典型的半胱氨酸结(六个保守的半胱氨酸残基形成三个二硫键)，该结构异常稳定，使得大环寡肽具有多种生物活性因而有作为药物设计框架的巨大应用潜力。然而，从植物组织提取天然AEP环化酶操作难度大，酶的得率低，2014年Nguyen GK研究发现来源于蝶豆的天冬酰胺内切酶butelase1可有效环化大环寡肽Kalata B1的前体，但butelase1并不能在大肠杆菌重组表达，在白花蛇舌草互补DNA文库中鉴定出三种表达的AEP同种型(OaAEP1-3)，并且对于OaAEP1的一个氨基酸进行突变(Glu371Val)得到第四种序列，命名为OaAEP1_b，以下简称为AEP。研究发现AEP环化酶可在大肠杆菌重组表达，其表达量为1.8mg/L，其表达量仍不能满足工业生产的要求。

许多工业酶以及药学相关蛋白的成功表达使甲基营养酵母巴斯德毕赤酵母成为最合适和最强大的蛋白质生产宿主系统之一。它也是膜蛋白和小生物活性和抗微生物肽表达的新兴宿主，它可能是化学合成的新选择。毕赤酵母具有以下优势：1、可以进行高密度发酵；2、可以进行真核生物的翻译后修饰；3、遗传背景清晰；4、含有调控严谨的强AOX1启动子和组成型强GAP启动子；5、可以进行胞外分泌。因此，发明人推测使用毕赤酵母对AEP环化酶进行表达是否会提高AEP环化酶的表达量。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种AEP环化酶在毕赤酵母中的表达方法及其应用。

本发明是这样实现的，一种AEP环化酶在毕赤酵母中的表达方法，包括以下步骤：

S1：构建pBDM-AEP载体；

S2：构建多拷贝pBDM-AEP质粒；

S3：将6*His标签构建至多拷贝pBDM-AEP质粒，构建含有His标签的AEP表达载体；

S4：pBDM-AEP-6*His摇瓶诱导表达。

进一步，步骤S2中所述多拷贝pBDM-AEP质粒为包含1-5之间任一整数个目的基因的表达框的质粒。

进一步，步骤S2中构建多拷贝pBDM-AEP质粒时，分别使用同尾酶Xba I和Spe I对载体进行酶切，完成连接。

进一步，在步骤S4后面增加AEP环化酶环化能力鉴定步骤。

进一步，所述AEP环化酶环化能力鉴定步骤包括：

步骤1：获取AEP环化酶的环化底物；

步骤2：AEP环化酶与环化底物反应；

步骤3：利用蛋白酶切割步骤2中的反应产物，并根据SDS-PAGE检测的目标条带结果判断AEP环化酶的环化能力。

进一步，步骤1中所述环化底物为包含SUMO蛋白酶底物序列的串联底物。

进一步，所述串联底物还包含TEV蛋白酶底物序列。