[发明专利]一种从批量contig中批量获取麦类植物LMW-GS基因编码区的方法

说明书

本发明公开了一种从批量contig中批量获取麦类植物LMW‑GS基因编码区的方法，其特征在于：本发明目的是克服从批量SeqMan组装出来的contig中批量获取不同麦类植物LMW‑GS基因编码区困难的问题。根据SeqMan组装出来的不同小麦材料中LMW‑GS基因的contig序列，先进行序列标识的批量重命名，并整理至同一个fasta格式的文件中；接着根据该基因N端、C端保守的特点，采用已经发表的中国春、小偃54的LMW‑GS基因编码区的两端各90bp序列为参比序列，与SeqMan组装出来的对应不同小麦材料中相应contig序列(即LMW‑GS基因的基因组DNA序列)进行比对，找到相应编码区的起始位置；最后根据起始位置从SeqMan组装出来的LMW‑GS基因contig中批量提取出编码区序列。这为进行该类基因的功能研究奠定了良好的基础。

技术领域

本发明属于分子生物学和生物信息学交叉的技术领域，具体涉及一种从批量contig中批量获取LMW-GS基因编码区的方法。

背景技术

小麦籽粒中的蛋白质包括清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和麦谷蛋白，其中清蛋白和球蛋白约占15％，为代谢蛋白；麦谷蛋白和醇溶蛋白约占85％，为小麦籽粒的主要贮藏蛋白，是小麦面筋的主要成分。贮藏蛋白的种类和特性决定了小麦面粉加工品质的优劣。小麦醇溶蛋白主要影响面团的延展性，麦谷蛋白主要决定面团的弹性，包括高分子量麦谷蛋白亚基(HMW-GS)和低分子量麦谷蛋白亚基(LMW-GS)，分别占胚乳总蛋白含量的10％和40％左右。从小麦种子中储藏蛋白各成份含量上来看，LMW-GS所占比例最高。从生产实践上看，不同的优质小麦品种年际间品质指标都有波动，有的波动甚至很大，从优质强筋直接下降到中强筋，甚至中筋水平。品质性状的波动与其控制基因的数量及表达有重要关系。

LMW-GS基因位于小麦第一同源群染色体短臂上，为单外显子基因，编码区长度约900bp～1200bp，为典型的多拷贝基因。其所编码的成熟蛋白亚基分子量变化在30～45kD之间，分子量大小主要取决于重复区的拷贝数，谷氨酰胺和脯氨酸占氨基酸总数的50％。据Southern杂交数据分析，估计六倍体小麦中LMW-GS基因总数变化在35～40之间，就每个小麦材料而言，A、B、D三个亚基因组上总拷贝数一般都为10～20个。从小麦籽粒蛋白产物分离上看，HMW-GS基因拷贝数较少，蛋白亚基分子量大，易于用单向SDS-PAGE区分，其等位基因变异及其与小麦品质的关系已得到广泛深入的研究。LMW-GS基因由于其拷贝数较多，蛋白亚基分子量小、且在电泳图谱上与大量的醇溶蛋白相互重叠，不容易区分，因此有关LMW-GS及其与品质之间关系的研究相对较难，相关研究成果报道也相对较少。因此，从DNA序列水平上先搞清不同品质类型小麦材料的LMW-GS基因构成，进而进行基因表达与相应品质性状间的关系研究不失为一个好的策略。

根据GenBank上收录的LMW-GS基因序列设计保守引物进行PCR扩增结合测序是搞清不同材料中LMW-GS基因构成的有效方法。由于LMW-GS基因不同拷贝在N端和C端间具有较高的序列相似性，采用基于Sanger法双脱氧测序的成本太高，采用Illumina公司的测序平台，由于其读长较短导致进行LMW-GS基因序列拼接时其保守的N端和C端容易误拼，而形成不同LMW-GS基因的嵌合基因。PacBio测序是单分子测序，且该平台测序的reads较长，平均都在5kb以上。由于LMW-GS基因PCR产物需要测序的片段较小(1kb左右)且PacBio的原始错误为随机错误，可以通过该公司的CCS测序模式进行单一片段多轮测序的自我纠正，来提高测序数据的准确性。CCS reads无需其它二代测序数据矫正，其本身就具有较高准确性。据PacBio官方数据，同一片段测序5次后，单一read的准确性可达99％以上。这为麦类植物基因组中多拷贝的LMW-GS基因组装提供了更有利的支持。