[发明专利]一种基于磁共振成像的活体示踪大脑神经连接的方法及其应用

说明书

本发明公开了一种基于磁共振成像的活体示踪大脑神经连接的方法及其应用，利用具有轴突末端吸收逆向运输特性的腺相关病毒变体rAAV2‑retro作为载体，在其基因组中装载铁蛋白Ferritin的基因，包装成重组病毒rAAV2‑retro‑CAG‑Ferritin‑WPRE‑pA，将上述重组病毒注射在大脑中，病毒感染神经元并在神经元内表达Ferritin，结合MRI观察其他脑区与注射位点被感染神经元之间的神经连接。本发明结合磁共振成像与rAAV2‑retro‑CAG‑Ferritin‑WPRE‑pA，实现了大脑神经连接的活体示踪，可用于长时程神经结构环路示踪或神经功能解析。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于磁共振成像的活体示踪大脑神经连接的方法，同时还涉及该方法在神经结构环路示踪及功能解析中的应用。

背景技术

大脑神经网络在机体中行使着重要的功能，参与学习、记忆、认知和情绪等各项活动，而多种神经系统疾病与神经网络的异常密切相关。解析大脑神经结构网络对于理解大脑的功能、工作机制、发育、退化以及神经疾病的发生发展有着重要的作用。近年来，嗜神经病毒，如狂犬病毒、水疱性口炎病毒、单纯疱疹病毒、伪狂犬病毒等，已被广泛用于神经网络解析，基于嗜神经病毒的神经环路示踪方法为神经网络解析提供了大量信息。然而，因为目前嗜神经病毒携带的报告基因多为荧光蛋白，此方法通常需要在嗜神经病毒感染神经元一段时间后将动物牺牲，对离体组织切片进行荧光成像观察，无法实现嗜神经病毒在活体中的观察，也就不适用于慢性的、长时程的、需要处理前后自身对比的实验。

磁共振成像是一种综合了非侵入性、高穿透性、适用于软组织和较高的时空分辨等多种优势的成像方法，已被广泛运用于临床诊断与科学研究。近年来，基于磁共振成像检测大脑神经网络结构及功能的方法得到了迅速发展和广泛应用，其中扩散张量成像(DTI)与锰离子增强磁共振成像(MEMRI)可用于大脑神经网络解剖结构的预测和示踪。然而，DTI方法基于数学模型预测纤维束的走向，其结果不能被直接认定为脑区之间的连接，并且其无法预测纤维束的投射方向，因此无法获得神经连接中的上下游关系。MEMRI的神经网络示踪结果常被解读为顺向跨多级突触神经连接，但其示踪剂锰离子可通过脑脊液和血管扩散，造成示踪结果的复杂性与非特异性。另外高于一定浓度的重金属锰离子对机体有较强的毒性，影响动物正常生理功能甚至直接造成动物死亡。

Ferritin是在多种生物体中高度保守存在的蛋白，是体内储存铁的主要形式之一。铁蛋白由24个亚基组成一个球形外壳，外壳中间的空腔可装载铁离子并形成顺磁性的氧化铁晶体，从而影响MRI信号。因此Ferritin的基因被认为是一种理想的磁共振成像报告基因。已有报道证明，携带Ferritin的腺病毒能感染神经元，并造成注射位点局部脑区的T2加权和T2*加权像的暗信号。然而由于腺病毒只能感染注射位点局部神经元，无法跨突触在神经元与神经之间传播，故无法显示出神经元之间的连接信息。

AAV是一类单链DNA病毒，作为基因载体，其具备免疫原性低、宿主细胞种类多和基因表达持久等优势，因此已被广泛应用于神经环路示踪以及基因治疗中。不同血清型的AAV具有不完全相同的感染特性，2016年有研究组通过人工定向进化的方法获得了rAAV2-retro血清型，这一血清型的AAV具有高效轴突末端吸收并经过逆向运输至投射神经元胞体的特性。因此rAAV2-retro血清型的AAV载体可以用于显示从轴突末梢到神经元胞体的神经投射信息，也可用于针对投射到特定脑区的神经元的基因导入。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于磁共振成像的活体追踪大脑神经连接的方法，可实现在活体大脑中显示不同脑区间的神经连接。

本发明的另一个目的在于提供了一种基于磁共振成像的活体追踪大脑神经连接的方法在神经结构环路示踪及功能解析中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种基于磁共振成像的活体示踪大脑神经连接的方法，包括以下步骤：