[发明专利]高产孢量紫色紫孢菌基因工程菌ΔPlflbD及其构建方法与应用

说明书

本发明公开了高产孢量紫色紫孢菌基因工程菌ΔPlflbD及其构建方法与应用，属生物农药技术领域。本发明基因工程菌ΔPlflbD为敲除紫色紫孢菌的PlflbD基因；基因工程菌的保藏编号为CCTCC M 2019347，PlflbD基因的序列如SEQ ID NO.1所示，PlflbD氨基酸的序列如SEQ ID NO.2所示。本发明构建PlflbD基因敲除载体；将供体质粒、受体、PflbD基因5’端同源重组片段和3’端同源重组片段进行Gateway BP反应得到PlflbD基因敲除载体；将PlflbD基因敲除载体转入农杆菌中；再将农杆菌转化紫色紫孢菌；筛选flbD转化子，并依次采用验证引物对引物flbD验证5/flbD验证3和随机引物对随机插入验证5/随机插入验证3进行验证，即得高产孢量紫色紫孢菌的基因工程菌ΔPlflbD。

技术领域

本发明涉及高产孢量紫色紫孢菌基因工程菌ΔPlflbD及其构建方法与应用，属生物农药技术领域。

背景技术

植物寄生线虫已经上升为仅次于真菌病害的第二大农业病害，其中尤以根结线虫和胞囊线虫的危害最为突出。

目前防治植物寄生线虫的方法主要是使用化学农药。但高毒化学农药的滥用往往产生危害人类健康和污染环境等负面效果。因此，早期使用的化学农药，包括克线磷、灭线磷、溴甲烷、涕灭威等几乎全部被禁用，使蔬菜基地根结线虫发生呈上升趋势。因此，研究开发安全和环境友好型杀线虫剂已经成为现代农业可持续发展中必须解决的关键问题。

由于主要化学杀线虫剂被禁用，利用自然界中线虫的天敌微生物进行生物防治成为本领域研究的热点。与传统化学农药相比，微生物菌剂具有安全、无污染、无残留等优点，同时也存在防效不高和不稳定等问题。

淡紫拟青霉是一类重要的食线虫真菌，淡紫拟青霉对多种植物线虫都有防治效能。淡紫拟青霉主要侵染植物寄生线虫的雌虫、胞囊和卵，而这种杀线虫方式往往更有利于控制土壤线虫的数量。紫孢菌属(Purpureocillium)，包含两个物种：淡紫紫孢菌(Purpureocillium lilacinum)(Luangsaard et al.,2011)和紫色紫孢菌(Purpureocillium lavendulum)(Perdomo et al.,2013)。与淡紫紫孢菌相比，紫色紫孢菌由于不能在35℃以上生长，其人畜安全性更高。

分生孢子是紫色紫孢菌侵染线虫的重要武器。对于食线虫真菌而言，分生孢子在侵染线虫过程中扮演着重要角色。分生孢子随着空气和水等流动媒介扩散传播，接触宿主后粘附于宿主体表或体内，待时机成熟后萌发(Herrera-Estrella et al.,2016)。萌发出的菌丝特化成附着胞等侵染结构并借助分泌的蛋白酶和几丁质酶等体壁降解酶的作用侵入宿主组织，随后杀死和消解宿主。因此大量的分生孢子是提高菌株杀虫效率的关键。分生孢子也是大部分线虫生防菌剂的制剂形式。

现有研究中，flbD基因作为曲霉产孢调控基因，通过敲除曲霉的flbD基因，却使得曲霉产孢量下降，使得产孢基因工程菌的研究停滞不前。

发明内容

为了提高紫色紫孢菌的产孢量，本发明提供高产孢量紫色紫孢菌基因工程菌ΔPlflbD及其构建方法与应用，本发明通过对紫色紫孢菌菌株进行基因改造，获得提高产孢数量的基因工程菌株，可用于开发高效生物杀线虫制剂；紫色紫孢菌基因工程菌株(Purpureocillium lavendulumΔPlflbD)与出发菌株相比具有相同的生长速率和形态；在PDA或MM培养基上培养10天后期产孢量比出发菌株分别提高4.6倍和3.3倍。

高产孢量紫色紫孢菌的基因工程菌ΔPlflbD，所述基因工程菌为敲除紫色紫孢菌的PlflbD基因；该基因工程菌株已于2019年5月10日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址：武汉大学保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2019347；菌株为紫色紫孢菌基因工程菌株Purpureocillium lavendulumΔPlflbD-1；