[发明专利]基于PCR-CRISPR-cas13a检测乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA的试剂盒

权利要求书

1.一种用于检测乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA的试剂盒，含有Cas13a蛋白和crRNA，或者所述Cas13a蛋白和所述crRNA形成的复合体；

所述crRNA包括用于与Cas13a蛋白结合的锚定序列和靶向乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA跨缺口区靶序列的向导序列；

所述乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA跨缺口区靶序列如SEQ ID No.4所示；

所述crRNA的序列如SEQ ID No.1所示；

所述试剂盒中还含有用于特异性扩增乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA的引物对；所述引物对由SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示两条单链DNA组成；

所述试剂盒中还含有如下：T7转录酶、NTP、RNA酶抑制剂、无RNA酶水、EcoR I酶、不降解质粒的ATP依赖的DNA酶、报告RNA、转录及CRISPR-Cas13a检测反应缓冲液；所述转录及CRISPR-Cas13a检测反应缓冲液为 10×buffer，组成如下：400 mM Tris-HCl，600 mM氯化钠，60 mM MgCl₂。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述Cas13a蛋白为LwCas13a蛋白。

3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述报告RNA为具有信号报告功能的RNA分子，当其中的RNA序列被降解时，能够报告阳性信号并被检测到。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述阳性信号为荧光信号。

5.一种检测乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA的非疾病诊断方法，包括如下步骤：

（a1）从待测样本中提取的总DNA，经EcoR I酶切后加入不降解质粒的ATP依赖的DNA酶消化非闭合线性DNA；

（a2）以步骤（a1）处理后样本为模板，采用由SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示两条单链DNA组成的引物对进行PCR扩增，得PCR产物；

（a3）配制转录和CRISPR-Cas13a检测体系：步骤（a2）所得PCR产物，权利要求1中所述Cas13a蛋白、权利要求1中所述crRNA、权利要求1中所述报告RNA、权利要求1中所述T7转录酶、所述NTP、所述RNA酶抑制剂、所述无RNA酶水、所述转录及CRISPR-Cas13a检测反应缓冲液；反应；检测阳性信号，根据阳性信号的有无判定所述待测样本中是否含有乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA；和/或根据阳性信号的强弱判定所述待测样本中含有多少乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤（a2）中，进行所述PCR扩增的反应条件为：95℃预变性10min；95℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 30s，循环30次；72℃延伸10min。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤（a3）中，所述反应的条件为：37℃，每2min检测一次所述阳性信号，共检测30次。

8.权利要求1-4中任一所述试剂盒在制备用于检测乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA的产品中的应用。

9.权利要求1-4中任一所述试剂盒在制备用于研究HBV致病机制的产品中的应用。

10.权利要求1-4中任一所述试剂盒在制备用于筛选乙肝药物的产品中的应用。

11.权利要求1-4中任一所述试剂盒在制备用于评价乙肝患者药物疗效的产品中的应用。