[发明专利]基于CRISPR技术改造酿酒酵母利用DL-蛋氨酸合成S-腺苷蛋氨酸的方法

权利要求书

1.基于CRISPR技术改造酿酒酵母利用DL-蛋氨酸合成S-腺苷蛋氨酸的方法，其特征在于，构建了一种基于CRISPR/Cas9的多倍体酿酒酵母基因组编辑方法；利用该方法对二倍体工业酿酒酵母进行基因组改造，强化酿酒酵母利用DL-蛋氨酸合成S-腺苷蛋氨酸的能力。

2.根据权利要求1所述的基于CRISPR技术改造酿酒酵母利用DL-蛋氨酸合成S-腺苷蛋氨酸的方法，其特征在于，构建的基于CRISPR/Cas9的多倍体酿酒酵母基因组编辑技术系统由在多拷贝质粒上表达的Cas9以及高拷贝质粒上表达的gRNA组成，或者Cas9与gRNA在高拷贝质粒上共表达；其基因组编辑方法包括基因敲入、基因敲除以及delta位点多拷贝整合。

3.根据权利要求2所述的基于CRISPR技术改造酿酒酵母利用DL-蛋氨酸合成S-腺苷蛋氨酸的方法，其特征在于，使用Cas9在多拷贝质粒上表达，gRNA在高拷贝质粒上表达的双质粒系统；优化gRNA质粒添加浓度与DNA修复模板浓度，构建高效基因敲入技术。

4.根据权利要求2所述的基于CRISPR技术改造酿酒酵母利用DL-蛋氨酸合成S-腺苷蛋氨酸的方法，其特征在于，使用Cas9在多拷贝质粒上表达，gRNA在高拷贝质粒上表达的双质粒系统，采用优化后的gRNA质粒添加浓度与DNA修复模板浓度，构建高效基因敲除技术。

5.根据权利要求2所述的基于CRISPR技术改造酿酒酵母利用DL-蛋氨酸合成S-腺苷蛋氨酸的方法，其特征在于，使用Cas9与gRNA在高拷贝质粒上共表达的单质粒系统，采用优化后的gRNA质粒添加浓度与DNA修复模板浓度，以G418抗性标签筛选，构建高效Delta位点整合技术。

6.根据权利要求1所述的基于CRISPR技术改造酿酒酵母利用DL-蛋氨酸合成S-腺苷蛋氨酸的方法，其特征在于，强化酿酒酵母利用DL-蛋氨酸合成S-腺苷蛋氨酸的能力的方法包括强化S-腺苷蛋氨酸合成途径以及引入D-蛋氨酸转化为L-蛋氨酸途径。

7.根据权利要求6所述的基于CRISPR技术改造酿酒酵母利用DL-蛋氨酸合成S-腺苷蛋氨酸的方法，其特征在于，强化S-腺苷蛋氨酸合成途径以及引入D-蛋氨酸转化为L-蛋氨酸途径的方法包括SPE2基因敲入SAM2基因表达框，GLC3基因敲入SAM2表达框，HPA3基因敲入DAAO与L-PheDH表达框以及SAH1基因位点敲入DAAO与L-PheDH表达框。

8.用权利要求1所述基于CRISPR技术改造酿酒酵母利用DL-蛋氨酸合成S-腺苷蛋氨酸的方法构建的重组菌生产S-腺苷蛋氨酸，其特征在于：从新鲜平板上挑取单菌落接种于5mL种子液体培养基，30℃、200rpm培养24h；全部接种于300mL种子培养基中，30℃、200rpm培养16h后，全部接种至含6L发酵培养基的10L发酵罐中；初始搅拌转速为200rpm，通气量为420L/h；发酵温度和溶解氧DO分别控制在30℃和20％，通过加入氨水将pH控制在5左右；当初始葡萄糖耗尽且乙醇低于2g/L，开始流加500g/L葡萄糖和12g/L酵母提取物的混合物以维持细胞生长；在对数中后期，前体DL-蛋氨酸以粉末的形式，每次添加40g，分5次加入发酵液中，转化阶段流加500g/L葡萄糖以维持细胞生长和转化；在发酵初期，当DO超过20％，开始上升时，提高补料流加速度，此时DO降低，通过调节搅拌转速和通气量控制DO为20％；当搅拌转速和通气量达到750rpm与840L/h，且DO低于15％时，开始降低补料流加速度；发酵过程每2h取样测量S-腺苷蛋氨酸的浓度；

种子培养基：20g/L葡萄糖，5g/L酵母提取物，5g/L(NH4)2SO4，2g/L K2HPO4，4g/LKH2PO4，0.1g/L MnSO4·H2O，0.1g/L ZnSO4·7H2O，0.5g/L MgSO4·7H2O，0.1g/L CaCl2；用于10L发酵罐合成SAM的种子培养；

发酵初始培养基：10g/L葡萄糖，3g/L酵母提取物，5g/L(NH4)2SO4，10g/L KH2PO4，0.1g/L MnSO4·H2O，0.6g/L ZnSO4·7H2O，0.55g/L FeSO4，3g/L MgSO4·7H2O，0.5g/LCaCl2，1.6mg/L CuSO4，0.5g/L NaCl，4.84mg/L钼酸铵，0.3mg/L生物素，3.6mg/L泛酸钙，3.6mg/L维生素B1，3.6mg/L维生素B；

生长期流加培养基：500g/L葡萄糖，12g/L酵母提取物；

转化期流加培养基：葡萄糖500g/L。