[发明专利]一种十字花科蔬菜立枯丝核菌的三重荧光定量PCR检测方法及试剂盒

权利要求书

1.一种十字花科蔬菜立枯丝核菌的三重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒中包括用于扩增检测立枯丝核菌融合群AG-2-1、AG-1-IB和AG-4HGII的3对引物及各自对应的探针，所述3对引物及其各自对应的探针序列分别为：

上游引物AG-2-1-F：GCTACAACCCCAAGTCGG；

下游引物AG-2-1-R：GTAAAAGCGTAAACCTGGGTG；

荧光探针AG-2-1-P：5’-FAM-CCTATCTCTGGATGGCACGGTGAC-TAMRA-3’；

上游引物AG-1-IB-F：AACAAGATGGACACTACCAAGG；

下游引物AG-1-IB-R：GGTCCTCGCTCCACTATAAAG；

荧光探针AG-1-IB-P：5’-VIC-AGTACAAACTCCACTCGGGTAACGACA-TAMRA-3’；

上游引物AG-4HGII-F：GCGCGGTAAAGGAATTTTGC；

下游引物AG-4HGII-R：GACAATAAATTTCGCTACCTTAGGC；

荧光探针AG-4HGII-P：5’-CY5-AAGGAGCCCTGCGGGTTATAAATATGTG-BHQ2-3’。

2.根据权利要求1所述的一种十字花科蔬菜立枯丝核菌的三重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括：三重荧光定量PCR检测预混液、空白对照品、阴性对照品以及阳性对照品；所述三重荧光定量PCR检测预混液包含上述3对引物和探针、qPCRMIX以及双蒸水；所述阳性对照品为AG-2-1、AG-1-IB、AG-4HGII的质粒混合品；所述阴性对照品为土传病原菌；所述空白对照品为DEPC-H₂O。

3.根据权利要求2所述的一种十字花科蔬菜立枯丝核菌的三重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品包括：

序列为SEQ ID NO:10所示的立枯丝核菌融合群AG-2-1质粒；

序列为SEQ ID NO:11所示的立枯丝核菌融合群AG-1-IB质粒；

序列为SEQ ID NO:12所示的立枯丝核菌融合群AG-4HGII质粒；

其中，

所述SEQ ID NO:10序列为：

5’-GCTACAACCCCAAGTCGGTCGCTTTCGTCCCTATTTCTGGATGGCACGGTGACAACATGTTGGAGGAGTCCGTCAAGTACGTCATACTGTCGCACCCAGGTTTACGCTTTTAC-3’；

所述SEQ ID NO:11序列为：

5’-GGTCCTCGCTCCACTATAAAGGTTGTCAGTACAAACTCCACTCGGGTAACGACATTATATGTACCTTGGTAGTGTCCATCTTGTT-3’；

所述SEQ ID NO:12序列为：

5’-GCGCGGTAAAGGAATTTTGCTTTTGATGATATAGTCCACATATTTATAACCCGCAGGGCTCCTTCGGAGTCCGGAGGGACCCCTCAGGGTAATATAAATATTAAAGCCTAAGGTAGCGAAATTTATTGTC-3’。

4.根据权利要求3所述的一种十字花科蔬菜立枯丝核菌的三重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述AG-2-1质粒的浓度为1.0×10⁹copies/μL；所述AG-1-IB质粒的浓度为1.0×10⁹copies/μL；所述AG-4HGII质粒的浓度为1.0×10⁹copies/μL。

5.根据权利要求2所述的一种十字花科蔬菜立枯丝核菌的三重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述土传病原菌为尖孢镰孢、茄病镰孢、胶孢炭疽菌、芸薹链格孢以及瓜果腐霉菌。