[发明专利]一种RAA荧光法检测非洲猪瘟病毒24个基因型通用引物、探针及检测方法

权利要求书

1.一种RAA荧光法非诊断治疗目的检测非洲猪瘟病毒24个基因型的检测方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1)提取待检样本DNA，获得DNA提取液；

(2)将恒温荧光基因检测仪接通电源进行预热，对反应参数进行设置；

(3)在42.5μL反应缓冲液中加入浓度为10μM的2μL引物和0.5μL探针，充分混合后添加到RAA荧光基础反应试剂中混合，得到反应预混液；

(4)将5μL所述步骤(1)中得到的DNA提取液与所述步骤(3)中得到的反应预混液充分混合，得到的反应体系放入恒温荧光基因检测仪检测荧光信号；

(5)根据扩增情况，在15分钟内有扩增曲线，判定为阳性；在15分钟内无扩增曲线，判定为阴性；

所述反应参数设置为39℃，反应时间：15分钟；

RAA荧光法检测非洲猪瘟病毒24个基因型的引物序列如下：

上游引物：5’-TAGTGATAGACCCCACGTAATCCGTGTCCCAAC-3’；SEQ ID NO.3；

下游引物：5’-CGATGATCCGGGTGCGATGATGATTACCTT-3’；SEQ ID NO.7；

所述上游引物和下游引物的使用浓度为10μM；

RAA荧光法检测非洲猪瘟病毒24个基因型的探针序列如下：

5’-GATACGTTAATATGACCACTGGGTTGGTATTCCTCCCGTGGCTTCAAAG-3’；SEQ ID NO.8；所述探针采用荧光报告基团和荧光淬灭基团进行修饰，荧光报告基团修饰在探针序列离5’端碱基数31bp的位置上；荧光淬灭基团修饰在探针序列离3’端碱基数16bp的位置上，荧光报告基团与淬灭基团之间间隔2个碱基CC，其中靠近3’端碱基C用四氢呋喃残基替换；

所述荧光报告基团为FAM、HEX、TET、JOE或VIC；所述荧光淬灭基团为BHQ1、BHQ2或BHQ3；

所述荧光报告基团为FAM；所述荧光淬灭基团为BHQ1；

所述探针的浓度为5～40μM。