[发明专利]一种水稻Wx基因突变的鉴定方法及其应用

权利要求书

1.一种水稻Wx基因突变的鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)以未经诱变处理的水稻植株为对照植物，以经诱变处理的水稻植株为待测植株，提取待测植株基因组构建DNA混合池，同时提取对照植株的基因组DNA；

(2)根据已公布的Wx基因序列，在其4、9、10外显子区域以及Wx^a和Wx^b差异位点设计巢式PCR外引物和内引物，分别以待测植株构建的DNA混合池和对照植株的基因组DNA为模板，加入所述巢式PCR引物的外引物，进行第1轮PCR扩增，扩增结束后加入ddH₂O稀释；

(3)以步骤(2)中PCR稀释后产物为模板，加入巢式PCR内引物和荧光染料，进行第2轮PCR扩增，扩增结束后，需再进行1个循环，第2轮PCR所得巢式PCR内引物扩增目的片段长度500bp；

(4)将步骤(3)所得第2轮扩增产物分别离心并转移至HRM检测板中，进行HRM检测分析，以对照植株所对应的HRM曲线为基准线，比较待测植株所对应的HRM曲线与对照植株所对应的HRM曲线的最大荧光差异ΔF；若|ΔF|0.05，视为待测植株与对照植株的结果不同，初步判定该DNA混合池中存在突变位点的植株，视为疑似突变混合池；

(5)将步骤(4)中筛选得到的疑似突变混合池对应的单株分别提取DNA并稀释，将单株DNA与对照植株DNA按一定比例混合进行巢式PCR扩增，扩增产物进行HRM检测分析，其方法同步骤(2)—(4)；

(6)以筛选得到的疑似突变单株DNA为模板进行PCR扩增，所用引物为步骤(2)中所述巢式RCR引物的外引物；

(7)PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，条带明显且单一的，进行测序，确定具体的突变位点；

其中，

所述针对Wx基因序列第4外显子区域设计的巢式PCR外引物和内引物，其序列如下：

EX4-O外引物-上游引物：5’—CAGATCATCACAAGATCGATTAGC—3’，

EX4-O外引物-下游引物：5’—AACCTGAAATCACCAGTGGAAG—3’，

EX4-I内引物-上游引物：5’—CCAAGTTTTTGTGGTGCAATTC—3’，

EX4-I内引物-下游引物：5’—TAAGCTCAGTCCAACTGCTAAATG—3’；

所述针对Wx基因序列第9外显子区域设计的巢式PCR外引物和内引物，其序列如下：

EX9-O外引物-上游引物：5’—CGACGGGTATGAGTAAGATTCTAAG—3’，

EX9-O外引物-下游引物：5’—CATTCGTTCTTACCGTGGTTG—3’，

EX9-I内引物-上游引物：5’—AGATCCTTTTGAGCTGACAACC—3’，

EX9-I内引物-下游引物：5’—GTACTTGGCGGTGATGTACTTG—3’；

所述针对Wx基因序列第10外显子区域设计的巢式PCR外引物和内引物，其序列如下：

EX10-O外引物-上游引物：5’—AGAACGAATGCATTCTTCACAAGA—3’，

EX10-O外引物-下游引物：5’—GCCTCACCCCTTCTAATTATTTGA—3’，

EX10-I内引物-上游引物：5’—ACAAGGCAAGAATGAGTGACAA—3’，

EX10-I内引物-下游引物：5’—GCATATCGTGCAAGTGTGTCTT—3’；

所述针对Wx基因序列Wx^a和Wx^b差异位点设计巢式PCR外引物和内引物，其序列如下：

Wxab-O外引物-上游引物：5’—GAGGGAGAGGGGGAGAGAGAGATC—3’，

Wxab-O外引物-下游引物：5’—TCCAGCCCAACACCTTACAGAAAT—3’，

Wxab-I内引物-上游引物：5’—CTTCACTTCTCTGCTTGTGTTGTT—3’，

Wxab-I内引物-下游引物：5’—CATGTGATCGATCTGAATAAGAGG—3’。

2.如权利要求1所述的水稻Wx基因突变的鉴定方法，其特征在于，所述步骤(2)中DNA混合池比例为1～9：1。