[发明专利]一种软骨细胞培养基及其制备方法

说明书

本发明涉及软骨细胞培养领域，具体涉及建立一种软骨细胞培养基及制备方法。该体系包括DMEM培养基，添加血清、重组人胰岛素、重组转铁蛋白、维生素C、人血清白蛋白、L‑脯氨酸、三碘甲腺原氨酸、非必需氨基酸、地塞米松等。分别配制基础培养基和各种组分的浓缩液，将各组分加入基础培养基中混匀即可。本发明提供的软骨细胞培养基可显著提高软骨细胞增殖能力，并维持软骨细胞特性。

技术领域

本发明属于软骨细胞培养基技术领域，涉及一种软骨细胞培养基及其制备方法。

背景技术

软骨细胞培养扩增技术在自体软骨细胞移植治疗骨缺损、软骨研究中处于重要地位。软骨细胞培养扩增的关键不仅要实现细胞较快速的增殖，而且要维持软骨细胞功能。软骨细胞具有一定增殖能力，体外条件下，贴壁培养可实现软骨细胞有限扩增，但增殖能力有限，扩增至第三代时即生长缓慢。而更为重要的是软骨细胞随扩增代数增加会逐渐去分化，失去软骨细胞的表型和功能。软骨细胞培养技术的发展直接影响软骨研究和疾病治疗的进步。

培养基是软骨细胞培养扩增中最重要的影响因素。目前，有关软骨细胞培养扩增主要采用添加动物血清的培养基。单一添加血清的培养基虽然能实现软骨细胞一定数量的扩增，但由于自体软骨在取样时都比较少，因而很难扩增到足够的移植数量；而且培养的软骨细胞容易去分化，失去软骨细胞特性。市售的改良软骨细胞培养基，虽然在促软骨细胞增殖方面有所改善，但仍非常有限。因而，现有软骨细胞培养基仍然无法满足对软骨细胞高效无分化培养扩增的要求。

为解决现有软骨细胞培养基存在的细胞增殖效率不够理想、易去分化等的问题，本发明通过大量试验筛选，得到一种新的软骨细胞培养基，该培养基不仅有效提高软骨细胞增殖率，而且能保持软骨细胞形态和功能。

发明内容

本发明的目的将通过下面的详细描述来进一步体现和说明。

本发明提供一种软骨细胞培养基及制备方法，该培养基包括基础培养基，添加如下组分及相应浓度：血清1-30%FBS、脯氨酸20-60μg/ml、维生素C 30-70μg/ml、ITS 1-20ml/ml、非必需氨基酸（NEAA） 1-20ml/ml、三碘甲腺原氨酸50-200nM。

上述基础培养基可以为低糖DMEM、DMEM/F12、MEM等，所述脯氨酸为L型脯氨酸，所述的维生素C为L-抗坏血酸，所述的ITS为胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂。

本发明提供的软骨细胞培养基中，通过添加三碘甲腺原氨酸50-200nM可大大抑制胰岛素带来的去分化效应；通过添加脯氨酸，可大大提高软骨细胞表型和功能的维持。

采用上述技术方案的软骨细胞培养基，可以实现软骨细胞快速增殖，且维持良好软骨细胞形态和功能。

优选地，本发明提供的软骨细胞培养基，包括基础培养基，添加如下组分及相应浓度：脯氨酸30-60μg/ml、维生素C 30-60μg/ml、ITS 1-15ml/ml、NEAA 1-15ml/ml、三碘甲腺原氨酸50-150nM 、FBS 5-30%。

相应地，本发明还提供软骨细胞培养基制备方法，包括如下步骤：

Ⅰ、按常规方法配制基础培养基，过滤除菌；配制L-脯氨酸母液、维生素C母液、三碘甲腺原氨酸母液等的100X浓缩液，过滤除菌。

Ⅱ、分别向基础培养基中加入L-脯氨酸母液、维生素C母液、三碘甲腺原氨酸、ITS母液、NEAA母液等。混匀后即得完全培养基。

相应地，本发明还提供软骨细胞培养基在软骨细胞培养中的用途。

本发明提供了一种新的软骨细胞培养基，与现有的含血清培养基和其他无血清培养基相比，该培养基培养的软骨细胞能够保持较好的细胞增殖速率和保持软骨细胞特性。本发明提供的制备方法简单，制得的软骨细胞培养基用于软骨细胞的培养，表现出优异的细胞性能。