[发明专利]无动物源性质粒DNA的制备方法

说明书

本发明公开了一种无动物源性质粒DNA的制备方法，包括如下步骤：步骤1，获得无动物源性试剂，包括无动物源性培养基，化学合成的抗生素；步骤2，使用无动物源性培养基制备无动物源的感受态细胞；步骤3，制备无动物源性RNaseA。本发明方法能够为生物医药领域提供无动物源的质粒DNA，更好的满足法规的需求；可以适用大量提取质粒DNA，通过使用自己生产的RNaseA使最终提取的质粒DNA无内毒素及动物源性污染。

技术领域

本发明涉及生物制药领域，具体涉及一种质粒DNA的制备方法，尤其涉及一种无动物源性质粒DNA的制备方法。

背景技术

质粒DNA制备是生物制药领域，特别是抗体药生产过程中必不可少的材料,它的制备处于生物医药产业链的最前端，承载了编码药物蛋白的关键性序列。质粒制备完成后会被转染进入哺乳动物细胞（如CHOK1,HEK293T,NS0等），进而表达相应的抗体或蛋白，因此保证质粒DNA的无动物源性是基因治疗、DNA疫苗和病毒生产以及生物大分子药物生产等领域所必须的。

传统的质粒DNA制备一般分为以下几个步骤：1. 质粒DNA的转化；2. 质粒在大肠杆菌Ecoli中扩增；3. 质粒的分离纯化。目前关于质粒制备的专利主要集中于通过不同的方法来提高质粒纯度或者增加质粒产量，而没有关于生产制备无动物性质粒DNA的方案。

经典的质粒DNA制备方法是使用碱裂解的方法，碱裂解法的原理是利用宿主菌染色体DNA与闭环双链质粒DNA的结构状态的差异来提取质粒DNA。当同时碱变性时，线状基因组DNA变性充分而质粒DNA处于拓扑缠绕的自然状态而不能彼此分开。当条件恢复时（酸中和），质粒DNA迅速准确配置重新形成完全天然超螺旋分子，而线状DNA则与破裂的细胞壁，细菌蛋白相互缠绕成大型复合物，被SDS(十二烷基磺酸钠)包盖从而形成沉淀被离心除去。该方法由于需要完全的人为操作，抽提得到质粒纯度不高，存在RNA污染，没有去除内毒素等原因主要用于科研用途。

目前已具有商业化的质粒抽提试剂盒，其原理与碱裂解法一致，但通过使用特殊的滤膜来去除内毒素，并通过硅基质吸附柱来纯化质粒DNA，试剂盒能够较快速获得高质量的质粒DNA，但试剂盒中使用RnaseA酶来去除RNA的污染，这些RnaseA都来自于牛胰腺，导致最终纯化得到的质粒DNA也不是无动物源性的，不能满足相关法规的要求。

不论是传统的碱裂解法还是商品化的提取试剂盒，上述两种方法除了在提取过程中引入了动物源性成分，在质粒转化和大肠感觉培养过程中也都使用了动物源性的培养基、固体平板、抗生素等，导致纯化得到的质粒DNA完全达不到生物医药领域无动物源的要求。

中国发明专利申请CN201510529938公开了一种质粒DNA提取方法，主要用于科研用途，缺点如下：

1、该方法适用于小量提取质粒DNA,每次提取的菌液量为3-4 ml；

2、提取的质粒未去除内毒素；

3、该方法提取的质粒DNA不是无动物源性的，因为中间使用了普通的抗生素、培养基和RNaseA,该方法获得的质粒DNA无法满足生物医药领域无动物源的需求。

目前国内没有无动物源质粒制备的技术和平台，而在生物医药领域，FDA和中国生物制品申报资料中均要求使用原料的无动物源性。因此，本领域亟需研发一种无动物源性质粒DNA的制备方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种无动物源性质粒DNA的制备方法，该方法可以适用大量提取质粒DNA，使最终提取的质粒DNA无内毒素及动物源性污染。