[发明专利]一种高效促进间充质干细胞成软骨分化的诱导体系及方法

说明书

本发明涉及间充质干细胞技术领域，具体涉及一种高效促进间充质干细胞成软骨分化的诱导体系及方法，诱导体系包括第一诱导培养基和第二诱导培养基，所述第一诱导培养基包括生长培养基和KGN，所述第一诱导培养基中KGN的浓度为0.5‑3μmol/L，所述第二诱导培养基包括软骨诱导分化培养基和添加剂，所述添加剂包括KGN，所述第二诱导培养基中KGN的浓度为10‑500nmol/L。本发明间充质干细胞先通过KGN预处理，然后以低浓度KGN诱导体系对细胞进行诱导，间充质干细胞能够向软骨细胞高效分化，仅需要8天即可看到较好的软骨细胞形成，培养时间短，成本低，见效显著。

技术领域

本发明涉及间充质干细胞技术领域，具体涉及一种高效促进间充质干细胞成软骨分化的诱导体系及方法。

背景技术

膝关节软骨组织受到创伤或疾病等的影响容易发生损伤，但关节软骨缺乏再生能力，软骨组织受损后很难修复。间充质干细胞(Mesenchymalstemcells,MSCs)来源于中胚层，理论上这种类型的细胞可以分化为中胚层的组织细胞，且具有很强的增殖能力和多向分化能力。间充质干细胞在人体内来源甚广，如脐带、胎盘，脂肪，骨髓，牙髓，脐带血等，在体外可以进行大规模的扩增。间充质干细胞具有很强的免疫调节功能，能够有效的促进机体内造血功能的恢复。同时能够在体内外特定条件下分化成骨细胞(Osteoblast)，脂肪细胞(Adipocyte)，成软骨细胞(Chondrocyte)，肌细胞(Myocyte)，神经细胞(Neuron)等多种组织细胞，对病变组织器官的修复起促进作用。在多种疾病的临床应用中展现出极佳的应用前景。

目前间充质干细胞在体外成软骨分化，多采用各类化合物的组合：HG-DMEM基础培养液，64μg/mLL-抗坏血酸，100mM非必需氨基酸，100ng/mL骨形态发生蛋白-2，10ng/ml人转化生长因子-β3，1％血清替代物，1％ITS-Premix，10-7M地塞米松，1％丙酮酸钠，40μg/mlL-脯氨酸。这些化合物中组合能够在体外诱导间充质干细胞成软骨分化时能够提高分化效率。在中国专利CN105695402A中公开了一种诱导间充质干细胞向软骨细胞分化的组合物和方法，组合物中除了包含上述中的几种化合物外，还包括0.5-5μg/ml吲哚美辛，0.5-10μg/ml氯地孕酮酯。表述为1ml含有1*106个细胞的细胞悬液加入15ml尖底离心管中，240g离心5分钟，将离心管加入37℃，5％CO2细胞培养箱中，约24h后轻轻晃动离心管，使细胞球与管底分离，之后换加入诱导分化培养基，所述诱导分化培养基为高糖DMEM中加入组合物，每隔24h轻轻晃动离心管一次，使细胞球与管底分离，每两天更换一次诱导分化培养基，21天后取出小球。这种方法是使用离心重力使得细胞聚集在一起，但是中心部位出现较多的细胞凋亡。

2012年Johnson等首次在Science发表发表题为“Astemcell-basedapproachtocartilagerepair”的原创性论文，提出使用一种全新的小分子化合物Kartogenin(KGN)可以有效作用于间充质干细胞，并用于治疗膝骨关节炎动物模型。

CN109207423A的中国专利公开了一种新型间充质干细胞成软骨诱导体系，包括第一诱导培养基和第二诱导培养基，所述第一诱导培养基包括生长培养基和小分子化合物KGN，所述小分子化合物KGN浓度为0.1-10μM；所述第二诱导培养基包括成软骨诱导培养基和TGF-β3，所述TGF-β3浓度为1-20ng/mL。创新性地将KGN预处理与传统诱导因子TGF-β3相结合，形成一种新的成软骨分化诱导体系：种子细胞体外培养过程中先经KGN预处理，再进行TGF-β3诱导，间充质干细胞能够向软骨细胞高效分化，且所形成的软骨细胞表型稳定，无明显骨化倾向。该发明显著提高间充质干细胞成软骨分化的效率，可更好地发挥其作为软骨组织工程种子细胞的作用。但是其诱导时间较长，需要至少28天，不符合产业化的高效需求。

发明内容

为了克服现有技术中存在的缺点和不足，本发明的目的在于提供一种高效促进间充质干细胞成软骨分化的诱导体系及方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：