[发明专利]一种食源致病微生物快速检测用Toehold结构及其应用

权利要求书

1.十种食源致病微生物的快速检测用Toehold结构的组合，其特征在于所述Toehold结构含有toehold、RBS和AUG，其序列如SEQ ID No.1-60所示。

2.与权利要求1所述Toehold结构的组合相匹配的trigger的组合，其特征在于所述trigger序列如SEQ ID No.61-120所示。

3.用于如权利要求1所述Toehold体外转录所需模板质粒的构建所用引物的组合，其特征在于所述引物序列如SEQ ID No. 121-238所示。

4.如权利要求2所述trigger组合体外合成所用引物的组合，其特征在于所述引物序列如SEQ ID No. 239-358所示。

5.如权利要求1所述的Toehold结构组合在快速检测食源性致病微生物中的应用，所述食源性致病微生物为十种常见食源性致病微生物，具体为金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌、蜡样芽孢杆菌、单增李斯特菌、大肠杆菌、伤寒沙门氏菌、产气肠杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌和酿脓链球菌。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于包括以下步骤：

1）待测样品处理：待测样品用生理盐水浸泡，取出待测样品，保留漂洗液；取出的待测样品加入等体积生理盐水，置均质器上处理10 分钟，除去残渣收集滤液，合并漂洗液；

2）待测样品RNA提取以及NASBA反应；

3）通过体外无细胞反应体系反应，其特征在于所述体外无细胞反应体系总反应体积为6 μL，包括：用于无细胞反应体系的购自NEB 或 EB6800 的试剂A 2.4 μL；用于无细胞反应体系的购自NEB 或 EB6800 的试剂 B 1.8 μL；Toehold 质粒模板 0.27 μL，待测样品RNA0.5 μL, RNA 酶抑制剂0.03 μL；反应时间90 分钟，荧光检测波长为587 nm/610 nm。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述步骤2）中还包括用于NASBA反应中的引物，所述引物序列如SEQ ID No. 359-378所示。