[发明专利]烟曲霉单宁酶突变体及其应用

说明书

本发明公开了一种烟曲霉单宁酶突变体。所述突变位点为Kex2蛋白酶切割位点K315‑R316。本发明通过对单宁酶AfTanA中Kex2蛋白酶位点K315‑R316对酶性质的影响分析，明确该位点对于酶的催化效率和稳定性影响较大，双点的缺失突变AfTanΔKR单宁酶表现出更加优良的酶学特性，具有在食品工业中发挥巨大作用的潜力。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种烟曲霉单宁酶突变体及其在柿子汁加工中的应用。

背景技术

单宁酶(Tannase EC 3.1.1.20)是可将单宁中的酯键与缩酚羧键断裂，生成葡萄糖和没食子酸等物质的一类酶的总称，在速溶茶、葡萄酒和啤酒等食品加工领域具有巨大的应用潜力。尽管人们对单宁酶的研究具有广泛兴趣和较长的历史，到目前为止，人们对单宁酶的研究主要集中在产酶微生物的筛选及产酶特性分析方面，仅有数个单宁酶基因被克隆并表达，涉及的微生物有米曲霉，黑曲霉、植物乳杆菌等。毕赤酵母作为优良的表达宿主，上百种酶基因已经在毕赤酵母中进行了高效表达。单宁酶基因富含二硫键、且以多聚体和高子量等特征，这使得单宁酶基因个克隆和表达具有较强的复杂性，探究影响单宁酶在毕赤酵母中因素意义重大。

发明人所在课题组前期从从浓香大曲中筛选获得产单宁酶嗜热真菌(A.fumigatus HBHF5)，该菌类种属条件致病菌，具有一定潜在的安全风险。为此，将该菌株中的单宁酶基因(afTanA)在P.pastoris GS115中进行了高效表达。检测发现毕赤酵母表达的重组单宁酶(AfTanA)由2个30kD左右大小亚基组成，且酶的稳定性降低，推测这些性质的改变与Kex2蛋白酶作用相关。单宁酶中普遍含有1-2个Kex2位点，AfTanA单宁酶中Kex2位点对酶学特性影响还不清楚。因此，亟待深入开展Kex2位点对单宁酶AfTanA性质影响的研究工作。

发明内容

本发明的目的在于提供一种烟曲霉单宁酶突变体，探讨Kex2蛋白酶酶切位点对该酶的pH稳定性、耐热稳定性及在柿子汁加工应用效果的影响，为单宁酶的生产及性能改造提供理论指导。

一种烟曲霉单宁酶突变体，所述突变位点为Kex2蛋白酶切割位点K315-R316。

含上述烟曲霉单宁酶突变体的基因的载体。

含上述烟曲霉单宁酶突变体基因载体的工程菌。

扩增上述的烟曲霉单宁酶突变体的基因中任一片段的引物。

上述烟曲霉单宁酶突变体在提高柿子汁抗氧化中的应用。

本发明的有益效果：本发明通过对单宁酶AfTanA中Kex2蛋白酶位点(K315-R316)对酶性质的影响分析，明确该位点对于酶的催化效率和稳定性影响较大，双点的缺失突变AfTanΔKR单宁酶表现出更加优良的酶学特性，具有在食品工业中发挥巨大作用的潜力。

附图说明

图1为使用I-TASSER构建的AfTanA分子模型及Kex2位点分析。

图2为单宁酶AfTanA及其突变体的SDS-PAGE电泳比较分析。

图3为单宁酶突变体的酶学性质比较分析。

图4为柿汁水解前后多酚类物质含量分析。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。

下述实施例所用材料与试剂：