[发明专利]一种用于单精子冷冻保存的空心琼脂糖球及制备方法

权利要求书

1.一种用于单精子冷冻保存的空心琼脂糖球，其特征是：该空心琼脂糖球的制备是：

步骤1)取10ml的海藻酸和碳酸钙的水溶液与20ml的含有卵磷脂及醋酸的石蜡油混合，得混合液；其中，水溶液中海藻酸为3％，碳酸钙为0.6％；石蜡油中卵磷脂为3％，醋酸为0.5％；上述百分比均为质量百分比；

步骤2)将步骤1)的混合液过150目筛网，得到直径在60–100μm的海藻胶小球；

步骤3)将步骤2)的海藻胶小球加入10ml质量百分比浓度为1％的琼脂糖溶液中，加热沸腾；

步骤4)将步骤3)含海藻胶小球的琼脂糖溶液注入到磁力搅拌的10ml石蜡油中，形成琼脂糖小球，待琼脂糖小球冷却后过150目筛网得到直径在80–120μm的琼脂糖小球；

步骤5)将直径在80–120μm的琼脂糖小球用清水洗净后加入50ml的柠檬酸溶液，柠檬酸溶液将琼脂糖小球中的海藻胶溶解后得到空心琼脂糖球。

2.根据权利要求1所述的一种用于单精子冷冻保存的空心琼脂糖球，其特征是：所述步骤4)含海藻胶小球的琼脂糖溶液是通过1ml针管进行注入。

3.一种用于单精子冷冻保存的方法，其特征是：利用如权利要求1或2所述的用于单精子冷冻保存的空心琼脂糖球，通过持针将该空心琼脂糖球固定，将筛选的精子注射入空心琼脂糖球中；将内有精子的空心琼脂糖球，转移至冷冻载杆上；然后将装有空心琼脂糖球的冷冻载杆，置于液氮泡沫盒上方10cm处开始熏蒸，经5min逐渐下降至液氮蒸汽内，再静置1min后，将冷冻载杆投入液氮，可长期保存。

4.根据权利要求3所述的一种用于单精子冷冻保存的方法，其特征是：具体包括如下步骤：

步骤S1：精子冷冻皿的制备

精子冷冻皿的制备：皿内包含一个PVP滴和数个精子注射滴，以及一个平铺的精子筛选滴，在无CO₂的37℃培养箱内过夜平衡，备用；其中，数个精子注射滴是用含10％SSS的m-HTF做成的液滴；

步骤S2：精子冷冻液的准备

不含蛋黄的精子冷冻液以1：1的比例用含10％SSS的m-HTF稀释而成；

步骤S3：精子解冻液的准备

添加1ml含10％SSS的mHTF液体于双井皿中，在无CO₂的37℃培养箱内过夜平衡，备用；

步骤S4：精子注射和冷冻

①在400X的放大倍数下，筛选活力好且无形态学畸形的精子；

②通过持针将空心琼脂糖球固定，将筛选的精子注射入到空心琼脂糖球中，根据具体情况，注射入1-5条精子；

③将内有精子的空心琼脂糖球，转移至冷冻载杆上，每个载杆装载1-3枚空心琼脂糖球；

④用镊子夹持装有空心琼脂糖球的冷冻载杆，置于液氮泡沫盒上方10cm处开始熏蒸，经5min逐渐下降至液氮蒸汽内，再静置1min后，将冷冻载杆投入液氮，可长期保存。

5.根据权利要求3或4所述的一种用于单精子冷冻保存的方法，其特征是：所述的精子为人类精子或非人类哺乳动物的精子。