[发明专利]一种高分辨率熔解曲线鉴定耳念珠菌的方法

权利要求书

1.一种高分辨率熔解曲线鉴定耳念珠菌的方法，包括如下步骤：

步骤一、准备待鉴定菌株包括耳念菌株和对照菌株的DNA模板；

步骤二、设计上下游引物；

步骤三、利用高分辨率溶解曲线技术HRM，获取各菌株高分辨溶解曲线图，具体为利用Real-time PCR技术，通过实时检测DNA熔解过程中荧光信号值的变化获取各菌株高分辨溶解曲线图；

步骤四、利用分析软件分析鉴定待鉴定菌株的具体类型；

步骤五、测定步骤三中结果为阳性菌株的核苷酸序列；

步骤六、验证鉴定方法的灵敏度。

2.如权利要求1所述的高分辨率熔解曲线鉴定耳念珠菌的方法，其特征在于，步骤一中对照菌株为近似同源物种希木龙念珠菌菌种复合体中各物种及变种，包括：Candidahaemulonii-希木龙念珠菌，Candida haemulonii var.vulnera-希木龙念珠菌vulnera变种，Candida duobushaemulonii-伪希木龙念珠菌，Candida pseudohaemulonii-假希木龙念珠菌；

其他念珠菌物种：Candida krusei-克柔念珠菌，Candida tropicalis-热带念珠菌，Candida albicans-白念珠菌，Candida nivariensis-尼瓦利亚念珠菌，Candidabracarensis-布加拉念珠菌，Candida glabrata-光滑念珠菌，Candida metapsilosis-似平滑念珠菌，Candida orthopsilosis-拟平滑念珠菌，Candida parapsilosis-近平滑念珠菌；

其他真菌物种：Aspergillus sydowii-聚多曲霉，Aspergillus flavus-黄曲霉，Alternaria alternate-链格孢菌，Cladosporium sphaerospermum-球孢枝孢菌，Curvularia lunata-月状弯孢菌，Fusarium solani-茄病镰刀菌，Hortaea werneckii-威尼克外瓶霉，Kodamaea ohmeri-奥默柯达菌，Talaromyces funiculosus-绳状篮状菌，Trichophyton rubrum-红色毛癣菌；

对照菌株选取上述菌中的部分菌株或全部菌株。

3.如权利要求2所述的高分辨率熔解曲线鉴定耳念珠菌的方法，其特征在于，步骤二中

上游引物为5'-CGTAGTATGACTTGCAGACG-3'，

下游引物为5'-GCGGGTAGTCCTACCTGAT-3'。

4.如权利要求3所述的高分辨率熔解曲线鉴定耳念珠菌的方法，其特征在于，步骤二中上下游引物使用Primer3引物设计软件进行设计，产物长度为200bp。

5.如权利要求4所述的高分辨率熔解曲线鉴定耳念珠菌的方法，其特征在于，步骤三中Real-time PCR反应体系包括2×Taqman qPCR Mix(Takara)15μL、上，下游引物各0.9μL、Rox Reference DyeⅡ(100×)0.3μL、Evagreen，20×in Water 1.5μL、DNA模板2μL，用灭菌纯水补足体系至30μL。

6.如权利要求5所述的高分辨率熔解曲线鉴定耳念珠菌的方法，其特征在于，步骤三中Real-time PCR反应条件为预变性：95℃10min；95℃15s，62℃40s，35个循环，升降温速度1.6℃/s。

7.如权利要求6所述的高分辨率熔解曲线鉴定耳念珠菌的方法，其特征在于，步骤三中高分辨溶解曲线技术HRM程序为：95℃10s，60℃1min，(0.025℃/s升温至)95℃15s，60℃15s，以1.6℃/s速率升降温，连续检测荧光强度。

8.如权利要求7所述的高分辨率熔解曲线鉴定耳念珠菌的方法，其特征在于，步骤四中利用high-resolution melting analysis软件进行结果分析。