[发明专利]一种用于HLA-LOSS检测和个体识别的引物、探针、试剂盒及方法

权利要求书

1.一种用于HLA-LOSS检测和个体识别的引物、探针、试剂盒及方法，其特征在于，所述检测引物及探针的序列如下所示：

正向引物：HLA-B*1502 F:5’-GCCGCGAGTCCGAGGATGGC-3’

反向引物1：HLA-B*1502 R1:5’-GTGTGTTGGTCTTGGAGATCTG-3’

反向引物2：HLA-B*1502 R2:5’-CGGTAAGTCTGTGTGTTGGTC-3’

荧光探针：TM-HLA-B*1502:5’荧光基团-ATAGAGCAGGAGGAGCCGGAGTAT-3’淬灭基团。

具体过程为：筛选HLA-LOSS检测引物和探针，基于数据库，从中筛选出针对人群中错配率高的HLA位点，它们分别为：

A*01:01；A*02:01；A*02:06；A*02:07；A*11:01；A*23:01；A*24:02；A*24:07；A*25:01；A*26:01；A*31:01；A*36:01；A*69:01；

B*15:01；B*15:02；B*35:01；B*40:01；B*46:01；B*51:01；B*58:01；

C*01:02；C*03:02；C*03:03；C*03:04；C*04:01:01:01；C*07:02；

DPB1*04:01；DPB1*08:01；DPB1*02:01；DPB1*04:02；DPB1*16:01；DPB1*17:01；

DPB1*01:01；DPB1*11:01；DPB1*13:01；DPB1*15:01。

2.一种用于HLA-LOSS检测和个体识别的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒由以下试剂组成：

A1、全血基因组DNA提取试剂，购于QIAamp DNA Blood Mini kit试剂盒；

B2、RNase-Free ddH₂O；

C3、2×Taqman Fast Advanced Master Mix反应液，购于Life；

D4、分别分装在相应编号离心管中的引物和探针组合。

3.根据权利要求2所述的一种用于HLA-LOSS检测和个体识别的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中每种引物的浓度为8μM，每种探针的浓度为4μM。

4.一种用于HLA-LOSS检测和个体识别的方法，其特征在于：其包含以下步骤：

S1、获取待测样品的DNA。

DNA提取可以采用QIAamp DNA Blood Mini kit试剂盒。

S2、首先采用INDEL个体识别技术，找出患者特有的INDEL标记位点，根据患者特有的INDEL标记位点计算出移植术后标本中患者细胞占比，根据移植后与移植前ΔCt的差值(ΔΔCt)，可以计算获得术后患者细胞嵌合率％＝2^-ΔΔCt×100％，其中ΔΔCt＝ΔCt_移植后-ΔCt_移植前＝(Ct_{标记基因移植后}-Ct_{内参基因移植后})-(Ct_{标记基因移植前}-Ct_{内参基因移植前})。

S3、采用本发明所述的HLA-LOSS检测引物和探针组合，或采用本发明所述的试剂盒，以步骤1中获取的DNA为模板，进行荧光PCR扩增，并收集荧光信号。

荧光PCR扩增的体系为20uL：10uL 2×Taqman Fast Advanced Master Mix反应液(Life)；1uL 8uM引物F；1uL 8uM引物R；1uL 4uM探针；1uL 30-40ng/uL DNA；用RNase-FreeddH₂O补足20uL反应体系。

荧光PCR的反应条件为：95℃预变性5min，然后95℃变性10s，60℃退火延伸30s，共进行40个循环，在60℃处收集荧光信号。

S4、根据INDEL个体识别技术待测样品进行微嵌合检测和根据HLA-LOSS检测移植术后患者HLA-LOSS。