[发明专利]一种高分辨率熔解曲线鉴定光滑念珠菌的方法

权利要求书

1.一种高分辨率熔解曲线鉴定光滑念珠菌的方法，包括如下步骤：

步骤一、准备待鉴定菌株包括光滑念珠菌、尼瓦利亚念珠菌、布加拉念珠菌和对照菌株的DNA模板；

步骤二、设计上下游引物；

步骤三、利用高分辨率溶解曲线技术HRM，获取各菌株高分辨溶解曲线图，具体为利用Real-time PCR技术，通过实时检测DNA熔解过程中荧光信号值的变化获取各菌株高分辨溶解曲线图；

步骤四、利用分析软件分析鉴定待鉴定菌株的具体类型；

步骤五、测定步骤三中结果为阳性菌株的核苷酸序列；

步骤六、验证鉴定方法的灵敏度。

2.如权利要求1所述的高分辨率熔解曲线鉴定光滑念珠菌的方法，其特征在于，步骤一中对照菌株为Candida albicans-白念珠菌，Candida tropicalis-热带念珠菌，Candidaparapsilosis-近平滑念珠菌，Candida metapsilosis-似平滑念珠菌，Candidaorthopsilosis-拟平滑念珠菌，Candida krusei-克柔念珠菌，Candida haemulonii-希木龙念珠菌，Candida duobushaemulonii-伪希木龙念珠菌，Candida haemuloniivar.vulnera-希木龙念珠菌vulnera变种，Candida pseudohaemulonii-假希木龙念珠菌，Candida auris-耳念珠菌，Trichosporon asahii-阿萨希毛孢子菌，Aspergillussydowii-聚多曲霉，Aspergillus flavus-黄曲霉，Alternaria alternate-链格孢菌，Cladosporium sphaerospermum-球孢枝孢，Curvularia lunata-月状弯孢菌，Fusariumsolani-茄病镰刀菌，Hortaea werneckii-威尼克外瓶霉，Kodamaea ohmeri-奥默柯达菌，Talaromyces funiculosus-绳状篮状菌，Trichophyton rubrum-红色毛癣菌中的全部菌种。

3.如权利要求2所述的高分辨率熔解曲线鉴定光滑念珠菌的方法，其特征在于，步骤二中

上游引物为5'-TCAACAATGGATCTCTTGGT-3'，

下游引物为5'-CCAACAATTTCAAGCTAACT-3'。

4.如权利要求3所述的高分辨率熔解曲线鉴定光滑念珠菌的方法，其特征在于，步骤二中上下游引物使用Primer3引物设计软件进行设计，产物长度为210bp。

5.如权利要求4所述的高分辨率熔解曲线鉴定光滑念珠菌的方法，其特征在于，步骤三中Real-time PCR反应体系包括2×Taqman qPCR Mix(Takara)15μL、上，下游引物各0.9μL、Rox Reference Dye Ⅱ(100×)0.3μL、Evagreen，20×in Water 1.5μL、DNA模板2μL，用灭菌纯水补足体系至30μL。

6.如权利要求5所述的高分辨率熔解曲线鉴定光滑念珠菌的方法，其特征在于，步骤三中Real-time PCR反应条件为预变性：95℃10min；95℃15s，58℃30s，35个循环，升降温速度1.6℃/s。

7.如权利要求6所述的高分辨率熔解曲线鉴定光滑念珠菌的方法，其特征在于，步骤三中高分辨溶解曲线技术HRM程序为：95℃10s，60℃1min，(0.025℃/s升温至)95℃15s，60℃15s，以1.6℃/s速率升降温，连续检测荧光强度。

8.如权利要求7所述的高分辨率熔解曲线鉴定光滑念珠菌的方法，其特征在于，步骤四中利用high-resolution melting analysis软件进行结果分析。