[发明专利]一种大豆结瘤中后期调控基因GmRSD及其应用方法

权利要求书

1.一种大豆结瘤中后期调控基因GmRSD，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示，其正向扩增引物如序列表中的SEQ IDNO：2所示，其反向扩增引物如序列表中的SEQIDNO：3所示。

2.一种如权利要求1所述的大豆结瘤中后期调控基因GmRSD的应用方法，其特征在于，包括以下操作步骤：

步骤一、提取大豆根瘤组织中总RNA；

步骤二、反转录PCR：在用焦碳酸二乙酯处理过的200μLPCR管中顺序加入5μL RNA和3μLoligo(dt)18；4μL dNTPs，65℃温育5min后迅速置于冰上冷却；

按以下顺序加入以下溶液：5倍M-MLV buffer 4μL，RNase inhibitor 1μL，M-MLV 1μL，0.1mol/L DTT 2μL；将上述反应液混匀，37℃反应30min；反应结束后，70℃处理10min灭活逆转录酶活性；反应合成的cDNA第一条链用作PCR反应模板；

步骤三、构建重组表达载体：

(1)GmRSD基因片段的克隆：根据GmRSD的编码序列SEQ IDNO：1设计引物对用于过表达载体构建，根据载体pEGAD上的多克隆位点，引物末端分别引入EcorR I和Hind III酶切识别位点；以cDNA为模板进行PCR，扩增GmRSD长为513bp的基因片段SEQ IDNO：1；引物序列为：

正向引物SEQ IDNO：2为：CGCGGATCC ATGTCTTATTGGAATTTCCCC；

反向引物SEQ IDNO：3为：GGGGTACC TCAAAAGAACGATCTAGTG；

扩增程序为：95℃ 5min；95℃ 30sec，56℃ 30sec，68℃ 2min，30个循环；72℃ 70sec；

PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，采用上海生工胶回收试剂盒回收纯化513bp的DNA片段；

回收的DNA片段与T载体连接：10μL体系中加入T载体1μL，回收的DNA片段4μL，混匀混合液，16℃连接过夜，热击法转入E.coli大肠杆菌感受态细胞，过夜培养，挑阳性克隆，测序；

(2)重组表达载体的构建：

a.提取含有正确测序的GmRSD 513bp基因序列的T载体质粒，用EcorR I和Hind III酶切获得核甘酸序列；

b.用EcorR I和Hind III酶切pEGAD质粒，获得线状的pEGAD核甘酸序列；

c.将GmRSD核甘酸序列片段先克隆到pEGAD载体中；

d.将步骤c的连接产物热激转化感受态大肠杆菌DH5α菌株，37℃过夜培养，挑取阳性克隆进行测序，得到重组质粒GmRSD-pEGAD；

步骤四、农杆菌K599介导的毛状根转化：

(1)将构建好的重组质粒转入农杆菌K599，采用液氮冻融法转化农杆菌K599，得到活化的农杆菌K599；

(2)挑选粒大、饱满、无病斑的成熟的大豆种子，采用氯气消毒法灭菌10h，播种在B5培养基上萌发5天，待大豆子叶即将张开却还未张开，挑选无污染、子叶完整未受损伤的切下子叶，在子叶下端十字交叉切割，浸在活化的农杆菌K599中侵染30min后，将外植体转至1/2MS培养基上共培养，生长3天后，再转至1/2MS培养基上诱导毛状根，7天后毛状根长出，待大豆真叶长出，毛状根达到7-8cm后，选择发育阶段接近的毛状根复合苗移入蛭石中，培养1周后接种根瘤菌USDA110，培养28天后统计根瘤数量。

3.根据权利要求2所述的一种大豆结瘤中后期调控基因GmRSD的应用方法，其特征在于，上述步骤一提取大豆根瘤组织中总RNA的具体操作为：

(1)取100mg大豆根材料用液氮研磨材料，加入1mL TRI pure试剂，充分匀浆后，将均浆液吸入1.5mL离心管，室温放置5min；

(2)加入200ul氯仿，震荡混匀，静置5min，4℃，12000r/min，离心10min；

(3)取上清于另一离心管，加等体积异丙醇，震荡混匀，-20℃沉淀30min，4℃，12000r/min，离心10min；

(4)弃上清，用1mL 75％的乙醇，用DEPC处理过的无菌水配制洗涤，4℃，12000r/min，离心10min，重复两次，室温风干10min左右，加20μL左右DEPC处理过的RNase Free水溶解沉淀。