[发明专利]一种用于α-半乳糖苷酶产生菌快速筛选的培养基及其应用

权利要求书

1.一种用于α-半乳糖苷酶产生菌快速筛选的培养基，其特征在于，所述的培养基是以下重量计的：蜜二糖5.0～10.0g、棉子糖5.0～10.0g、水苏糖5.0～10.0g、蛋白胨5.0～8.0g、KCl 0.1～0.3g、Na₂HPO₄ 0.2～0.5g、MgSO₄·7H₂O 0.5～1.0g、MnSO₄ 0.1～0.3g、X-α-Gal 0.02～0.04g和琼脂20.0g加蒸馏水至1000mL，调pH7.1～7.5制成；其中，首先把X-α-Gal溶解于二甲基甲酰胺中，制成质量浓度为20mg/mL的X-α-Gal溶液，0.22µm滤膜过滤除菌，得过滤除菌后的X-α-Gal溶液，备用；再将其余组分用蒸馏水溶解， 121℃灭菌20分钟，冷却至55℃，然后加入上述过滤除菌后的X-α-Gal溶液，混匀，加无菌蒸馏水至1000mL，用盐酸或氢氧化钠调节为pH7.1～7.5，快速倒平板，即成α-半乳糖苷酶产生菌快速筛选的培养基平板。

2.根据权利要求1所述的用于α-半乳糖苷酶产生菌快速筛选的培养基，其特征在于，所述的培养基是以下重量计的：蜜二糖5.0g、棉子糖5.0g、水苏糖5.0g、蛋白胨5.0g、KCl0.1g、Na2HPO4 0.2g、MgSO4·7H2O 0.5g、MnSO4 0.1g、X-α-Gal 0.02g和琼脂20.0g加蒸馏水至1000mL，调pH7.1～7.5制成；其中，首先把X-α-Gal溶解于二甲基甲酰胺中，制成质量浓度为20mg/mL的X-α-Gal溶液，0.22µm滤膜过滤除菌，得过滤除菌后的X-α-Gal溶液，备用；再将其余组分用蒸馏水溶解， 121℃灭菌20分钟，冷却至55℃，然后加入上述过滤除菌后的X-α-Gal溶液，混匀，加无菌蒸馏水至1000mL，用盐酸或氢氧化钠调节为pH7.1～7.5，快速倒平板，即成α-半乳糖苷酶产生菌快速筛选的培养基平板。

3.根据权利要求1所述的用于α-半乳糖苷酶产生菌快速筛选的培养基，其特征在于，所述的培养基是以下重量计的：蜜二糖10.0g、棉子糖10.0g、水苏糖10.0g、蛋白胨8.0g、KCl0.3g、Na2HPO4 0.5g、MgSO4·7H2O 1.0g、MnSO4 0.3g、X-α-Gal 0.04g和琼脂20.0g加蒸馏水至1000mL，调pH7.1～7.5制成；其中，首先把X-α-Gal溶解于二甲基甲酰胺中，制成质量浓度为20mg/mL的X-α-Gal溶液，0.22µm滤膜过滤除菌，得过滤除菌后的X-α-Gal溶液，备用；再将其余组分用蒸馏水溶解， 121℃灭菌20分钟，冷却至55℃，然后加入上述过滤除菌后的X-α-Gal溶液，混匀，加无菌蒸馏水至1000mL，用盐酸或氢氧化钠调节为pH7.1～7.5，快速倒平板，即成α-半乳糖苷酶产生菌快速筛选的培养基平板。

4.根据权利要求1所述的用于α-半乳糖苷酶产生菌快速筛选的培养基，其特征在于，所述的培养基是以下重量计的：蜜二糖7.5g、棉子糖7.5g、水苏糖7.5g、蛋白胨6.5g、KCl0.2g、Na2HPO4 0.35g、MgSO4·7H2O 0.75g、MnSO4 0.2g、X-α-Gal 0.03g和琼脂20.0g加蒸馏水至1000mL，调pH7.1～7.5制成；其中，首先把X-α-Gal溶解于二甲基甲酰胺中，制成质量浓度为20mg/mL的X-α-Gal溶液，0.22µm滤膜过滤除菌，得过滤除菌后的X-α-Gal溶液，备用；再将其余组分用蒸馏水溶解， 121℃灭菌20分钟，冷却至55℃，然后加入上述过滤除菌后的X-α-Gal溶液，混匀，加蒸馏水至1000mL，用盐酸或氢氧化钠调节为pH7.1～7.5，快速倒平板，即成α-半乳糖苷酶产生菌快速筛选的培养基平板。

5.权利要求1-4所述的用于α-半乳糖苷酶产生菌快速筛选的培养基在α-半乳糖苷酶产生菌快速筛选中的应用，包括以下步骤：

（1）无菌条件下用称取1.0g采集土样加入装有100mL灭菌冷却后的富集培养基中，于32℃、160r/min摇床震荡培养25h，得富集培养液；

所述富集培养基是由蜜二糖5.0g、棉子糖5.0g和水苏糖5.0g加蒸馏水至1000mL制成；

（2）取富集培养液分别用无菌水稀释至10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，分别取10-3、10-4、10-5、10-6、10-7稀释度涂布于α-半乳糖苷酶产生菌快速筛选的培养基平板表面，32℃恒温培养箱中培养35h，用接种环挑取蓝色单菌落进一步划线纯化，将纯化后的单菌落转接于菌种保藏培养基斜面试管上，32℃培养，观察菌落的生长情况，待长满菌落，即为α-半乳糖苷酶产生菌菌株，进行记录编号，置于甘油管中，放4℃冰箱中保存，备用；

（3）筛选出α-半乳糖苷酶产生菌菌株接种于液体培养基100 mL三角瓶中，32℃、160r/min摇床震荡培养35h，发酵培养液于4℃、10000r/min离心10min，收集上清液用于α-半乳糖苷酶酶活性分析；

所述的液体培养基是由：蜜二糖5.0g、棉子糖5.0g、水苏糖5.0g、蛋白胨5.0g、KCl0.1g、Na2HPO4 0.2g、MgSO4·7H2O 0.5g和MnSO4 0.1g加蒸馏水至1000mL，用盐酸或氢氧化钠调节为pH7.2制成，121℃灭菌20分钟；

所述的α-半乳糖苷酶酶活性分析：α-半乳糖苷酶的活力单位：在37℃，pH 5.0条件下，1min分解底物对硝基酚-α-D-吡喃半乳糖苷生成1µmol对硝基苯酚所需的酶量为1个酶活力单位；

1.0mL底物ρNPG于37℃水浴预热2min，加入稀释酶液1.0mL，37℃水浴恒温震荡10min，加入8.0mL0.2mol/L碳酸钠溶液终止反应，以蒸馏水调零，在405nm下测量OD值；标准空白用稀释酶液1.0mL，先加入8.0mL0.2mol/L碳酸钠溶液震荡混匀，再1.0mL底物ρNPG于37℃水浴恒温震荡10min，以蒸馏水调零，在405nm下测量OD值：

计算公式：α-半乳糖苷酶酶活力（U/ mL）A＝[(Ax- A0)×K+C0]×Df/vt

式中：Ax样品酶液吸光度OD值；A0空白吸光度OD值；K对硝基酚标准曲线的斜率；C0对硝基酚标准曲线的截距；Df稀释倍数；v吸取样品酶液体积/mL；t反应时间/min。