[发明专利]一种基于CMV RNA2的体外干扰黄瓜花叶病的制剂、其制备方法与应用有效
| 申请号： | 201910729204.1 | 申请日： | 2019-08-08 |
| 公开（公告）号： | CN110468129B | 公开（公告）日： | 2023-03-24 |
| 发明（设计）人： | 杨辉;刘信娴;杨洋;汪蝶;向金友;杨懿德;余志凡 | 申请（专利权）人： | 四川农业大学;四川省烟草公司宜宾市公司 |
| 主分类号： | C12N15/113 | 分类号： | C12N15/113;A01N57/16;A01P1/00;A01G7/06;A01G22/05 |
| 代理公司： | 北京君智知识产权代理事务所(普通合伙) 11305 | 代理人： | 黄绿雯 |
| 地址： | 611130 四*** | 国省代码： | 四川;51 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 基于 cmv rna2 体外 干扰 黄瓜 花叶病 制剂 制备 方法 应用 | ||
1.黄瓜花叶病毒(
2.含有权利要求1所述的黄瓜花叶病毒(
3.一种体外干扰黄瓜花叶病的制剂的制备方法，所述方法包括以下步骤：
（1）获取权利要求1所述的黄瓜花叶病毒(
（2）取步骤（1）的RNA2片段与2×GKP接种缓冲液等体积混合均匀，再加入以总体积百分数计1%~5%的吐温-80；混合均匀后即为所述制剂。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于步骤（1）的RNA2片段的制备方法包括以下步骤：
（1.1）取黄瓜花叶病毒(
（1.2）以步骤（1.1）的总RNA为模板反转录为cDNA，利用特异性引物CMVRNA2F和CMVRNA2R进行PCR扩增，得到CMV-RNA2的DNA片段，其中，所述特异性引物的序列为：
CMVRNA2F:
CMVRNA2R:
（1.3）将步骤（1.2）得到的DNA片段在T7 RNA转录酶作用下转录为RNA，65℃温浴10分钟，室温放置2~6小时获得降解的黄瓜花叶病毒(
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述步骤（1.2）的扩增体系是cDNA 3µl，10µmol/L的上下游引物各0.5µl，ExTaq 0.5µl，10×ExTaq Buffer 2µl，dNTP Mixture 1µ，加ddH2O 12.5µl补足到20µl；扩增条件是94℃预变性2分钟；94℃变性30秒，53℃退火30秒，72 ℃延伸1分钟；72 ℃10分钟，共33个循环，得到CMV-RNA2的DNA片段。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于步骤（1）的RNA2片段的制备方法包括以下步骤：
（1.1）取黄瓜花叶病毒(
（1.2）以步骤（1.1）的总RNA为模板反转录为cDNA，利用特异性引物CMVRNA2F和CMVRNA2R进行PCR扩增，得到CMV-RNA2的DNA片段，其中，所述特异性引物的序列为：
CMVRNA2F:
CMVRNA2R:
（1.3）将步骤（1.2）得到的DNA片段构建于T载体得到重组质粒，将所述重组质粒转化大肠杆菌DH5α菌株并提取质粒，酶切质粒获得线性化含CMV-RNA2的DNA片段；
然后将线性化含CMV-RNA2的质粒在T7 RNA转录酶作用下转录为RNA，65℃温浴10分钟，室温放置2~6小时获得降解的黄瓜花叶病毒(
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