[发明专利]利用二重实时荧光定量RT-PCR检测猪流行性腹泻病毒和B型猪肠道病毒的方法

说明书

本发明涉及病毒检测技术领域，具体涉及利用二重实时荧光定量RT‑PCR检测猪流行性腹泻病毒和B型猪肠道病毒的方法。本发明提供用于猪流行性腹泻病毒和B型猪肠道病毒的二重实时荧光定量RT‑PCR检测的引物和探针组，以及包含该引物和探针组的检测试剂盒和检测方法。该方法的检测特异性高、重复性好、灵敏度高，同时具有操作简便，检测时间短等优势，可实现对猪流行性腹泻病毒和B型猪肠道病毒的鉴别诊断和排除检测，在猪流行性腹泻病毒和B型猪肠道病毒的快速检测中具有较高的应用价值。

技术领域

本发明涉及病毒检测技术领域，具体涉及用于二重实时荧光定量RT-PCR检测猪流行性腹泻病毒和B型猪肠道病毒的特异性引物和探针，本发明还涉及利用该特异性引物、探针进行二重实时荧光定量RT-PCR检测或鉴别猪流行性腹泻病毒和B型猪肠道病毒的方法和试剂盒。

背景技术

随着养猪业的发展，仔猪腹泻对养猪业造成的危害严重，引起仔猪腹泻的原因有病毒性、细菌性、饲料因素和环境因素等，其中，病毒性腹泻对仔猪的危害尤为严重，病毒性腹泻致病原的早期快速鉴别诊断对成功治疗和预防疾病的爆发至关重要。

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的以猪呕吐、急性水样腹泻、脱水以及仔猪的高死亡率为临床特征的一种接触性的肠道传染病。PEDV可以感染各个年龄阶段的猪，对1周龄以内的仔猪感染最为严重，在无母源抗体保护情况下，发病率100％，死亡率为90-100％，给世界各国养猪业带来巨大经济损失。

猪肠道病毒(Porcine enteroviruses,PEVs)属于小核糖核酸病毒科，可引起猪的消化道疾病、神经系统疾病、繁殖障碍和表皮损伤等病症，在英国、匈牙利、韩国和中国均有分离到该病毒的报道。依据病毒致细胞病变(Cytopathic effect,CPE)和血清学试验特性，肠道病毒可分为3个群。B型猪肠道病毒Ch-SDbz-W2Y毒株(保藏编号为CGMCC No.10405)属于III型细胞病变群，该毒株也可致哺乳仔猪发生腹泻、呕吐等症状，并导致死亡，与PEDV具有非常相似的临床症状，仅仅依靠临床解剖无法进行鉴别诊断，因此需要开发实验室快速检测方法进行辅助确诊。

实时荧光PCR检测技术已经广泛应用到各个研究领域，具有操作简单、敏感性高、特异性强、可实现多通道快速检测等优点，是动物疾病快速检测的首选方法。目前，已经建立PEDV的实验室检测方法，包括普通PCR和荧光定量PCR方法。然而国内外还未见有PEDV与PEV-B鉴别诊断的实验室方法。

发明内容

本发明的目的在于提供用于二重实时荧光定量RT-PCR检测猪流行性腹泻病毒和B型猪肠道病毒的特异性引物和探针，以及具有高度特异性和灵敏度、可重复性好的猪流行性腹泻病毒和B型猪肠道病毒的检测方法。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

在数据库中检索并下载猪流行性腹泻病毒和B型猪肠道病毒的基因组序列，基于序列分析和比对结果筛选在不同的猪流行性腹泻病毒之间具有高度保守性以及在B型肠道病毒不同毒株之间具有高度保守性且具有B型特异性的序列作为检测的靶序列，最终确定以PEDV的N基因片段和PEV-B的5’-UTR片段为靶序列。根据上述靶序列分别设计特异性引物和探针，经大量筛选和人工优化获得序列如SEQ ID NO.1-4所示的特异性引物，该引物可单独或配合序列如SEQ ID NO.5-6所示的探针实现特异高效的荧光定量RT-PCR扩增，基于此，本发明开发了PEDV和PEV-B的二重实时荧光定量RT-PCR检测方法。

具体地，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供用于猪流行性腹泻病毒和B型猪肠道病毒的二重实时荧光定量RT-PCR检测的引物组，所述引物组包含2对特异性引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1-4所示。