[发明专利]诱导多能干细胞分化为搏动心肌细胞的诱导剂及其应用

说明书

本发明提供了诱导多能干细胞分化为搏动心肌细胞的诱导剂及其应用，具体地本发明公开了一种诱导多能干细胞定向分化为搏动心肌细胞的诱导剂，该诱导剂为小分子化合物WIKI4，其具有高效诱导多能干细胞向心肌细胞进行分化的作用。

技术领域

本发明涉及细胞生物学和再生医学领域，具体地说，本发明涉及一种诱导多能干细胞分化为搏动心肌细胞的诱导剂及其应用。

背景技术

据世界心脏联盟统计，在世界范围内每死亡三个人中就有一人的死因与心血管疾病有关。心脏病已然成为人类健康的头号杀手。人心肌组织中的干细胞有限，分化能力差，细胞坏死或凋亡后心肌难以修复，导致心肌细胞数量减少，心率失常，最终造成心力衰竭。我国心血管病危险因素流行趋势明显,心血管病患病率及死亡率仍处于上升阶段。据《中国心血管病报告2016》推算我国心血管病现患人数2.9亿,其中脑卒中1300万,冠心病1100万,心力衰竭450万,肺原性心脏病500万,风湿性心脏病250万,先天性心脏病200万,高血压2.7亿；心血管病死亡率居首位,高于肿瘤和其他疾病,占居民疾病死亡构成的40％以上,特别是农村,近几年来心血管病死亡率持续高于城市水平。心脑血管病住院总费用也在快速增加,2004年至今,其年均增速远高于GDP增速。我国心血管疾病负担日渐加重,已成为重大的公共卫生问题,防治心血管病刻不容缓。

诱导人多能干细胞定向分化为心肌细胞，有望为心肌梗死、心肌坏死等重大心脏疾病患者提供治疗细胞修复受损心肌细胞；为构建器官移植用的人造心脏提供种子细胞；为体外研究心脏发育提供充足的细胞材料；为体外药物筛选和药物心脏毒性评价提供良好的细胞模型。

已有研究表明，人多能干细胞可分化为多种细胞，包括心肌组织中的多种细胞。目前诱导人多能干细胞定向分化为心肌细胞的主要方法如下：

1.类胚体法

人多能干细胞在体外培养的过程中细胞间会自发或通过悬滴法聚集形成类胚体，悬浮培养10天后贴壁，在不添加额外的诱导因子下，可自发产生搏动的心肌细胞，但是效率较低，只能达到5～15％。在添加激活素-A(Activin A)、骨形态发生蛋白4(BMP4)、成纤维细胞生长因子(FGF)等诱导因子的情况下，可提高心肌细胞的诱导效率，达到70％左右。

尽管此法在诱导因子的作用下心肌细胞诱导效率有所提升，但效率依然有限，不能满足细胞移植治疗的目的。此外，此法的不可控因素较多，如类胚体的大小难以统一，类胚体细胞量的变化直接导致类胚体产生心肌细胞的数量和质量差异；细胞间相互作用机制仍不清楚，细胞株类型及培养方法的差异将直接影响诱导效率。

2.共培养法

共培养法依赖于动物细胞，人多能干细胞与小鼠内胚层样细胞(END2)共培养，从而产生合同心肌细胞。此法模拟细胞发育调控机制，内胚层样细胞可分泌多种细胞因子，从而诱导多能干细胞向心肌细胞分化。这是一种比较原始的方法，诱导效率也只能达到35％左右。

此法模拟了细胞发育的调控机制，但是具有诱导效率低和需要使用动物源细胞等缺点。

3.转基因法

转基因法能将特定的基因通过转染到多能干细胞，促进其分化成心肌细胞。目前的方法有：转染Nkx2.5基因，心肌特异性α肌球蛋白重链启动子和增强绿色荧光蛋白标记基因联合转染，转染阿尔法肌球蛋白启动子联合嘌呤毒素抗性基因、表皮生长因子基因和增强绿色荧光蛋白标记基因，共同转染miRNA-208和miRNA-133a，转染不同组合的miRNA-1和miRNA-133，转染钠钙交换体启动子。该方法的机理是通过上调心肌细胞相关的特异性基因、miRNA和启动子，激活心肌发育相关的信号传导通路，诱导多能干细胞向心肌细胞分化。