[发明专利]一种靶向巨噬细胞过表达基因小鼠模型的制备方法

权利要求书

1.一种靶向巨噬细胞过表达基因小鼠模型的制备方法，其特征在于步骤为：

1）首先制备编码目标基因慢病毒颗粒的重组病毒质粒及其辅助包装原件载体质粒，使用Buffer A进行共转染HEK293T细胞，转染后16-18h 更换为完全培养基，培养48~72h后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，初步过滤后，将其进行浓缩得到高滴度的慢病毒浓缩液；

2）取3-4周龄Lyz2-Cre小鼠股骨和胫骨，用含有10wt.%FBS，1wt.% P/S以及1wt.% NEAA的DMEM培养液冲洗骨髓腔，经 BD Falcon™ 100 µ m 细胞过滤网过滤，收集骨髓腔提取物，于4℃、1000g 离心10 min，弃上清，以5mL红细胞裂解液重新悬浮细胞，于室温下孵育1分钟；经PBS清洗后，用含有10wt.%FBS，10ng/mL IL-3，10ng/mL IL-6，10ng/mL Stem cellfactor的DMEM条件培养基重悬细胞，并计数种于10cm培养皿中，置CO₂培养箱中培养；

3）细胞培养过夜后，收集悬浮细胞，于4℃、1000g 离心10分钟，弃上清；PBS液洗涤细胞2次；用10mL DMEM条件培养基重悬细胞，种板于12孔板，1mL/孔；每孔加入慢病毒，1800g，120分钟悬浮感染；后将细胞放入培养箱继续培养，隔天进行骨髓移植；

4）（1）提前一周准备体重23-25g C57/B6小鼠，以抗生素水喂养一周，所述抗生素水组成为1L去离子水+100mg新霉素+10mg多粘菌素+700μL浓盐酸；（2）一周后，对步骤（1）C57/B6小鼠按7-9格雷剂量进行辐照；（3）步骤（2）辐照小鼠休息4-6小时后，收集病毒感染悬浮细胞，1000g，10分钟离心；用含10ng/mL IL-3，10ng/mL IL-6，10ng/mL stem cell factor的PBS洗涤细胞；弃上清，用PBS重悬细胞，将骨髓细胞尾静脉注射入辐照受体小鼠内完成模型制备。

2.根据权利要求1所述靶向巨噬细胞过表达基因小鼠模型的制备方法，其特征在于所述慢病毒浓缩液的制备方法为：（1）HEK293T细胞准备：用0.05wt.%Trypsin-EDTA消化HEK293T细胞，按1:4传代，加入完全培养基，所述完全培养基组成为DMEM+10wt.% FBS+1wt.%青链霉素，置CO₂培养箱中培养，待细胞融合度100%准备转染；（2）转染前换液：转染前1～2h将细胞培养基更换为不含青链霉素的完全培养基，6mL/10cm培养皿；（3）转染：取无菌的1.5mL EP管，按下列组分配制反应体系，混匀后，室温静置20min～30min，均匀加入步骤2）的细胞中，后置于CO₂培养箱中培养；转染1块10cm培养皿的用量：DMEM 1mL，携带目标基因片段的慢病毒载体DNA 10μg，Pla-Mix 10μL，Buffer A 60μL；（4）换液：转染18～20h后，弃步骤（3）的细胞培养上清，加12mL 新鲜的培养基继续培养，所述新鲜的培养基组成为DMEM+10wt.%FBS+1wt.%Buffer B；（5）病毒上清收集：48h～72h后，吸取细胞上清液于50mL离心管中，4℃，3000rpm，离心5min；（6）病毒过滤：准备0.45μm孔径滤器，用2～3mL 5wt.% BufferC润湿，使用前用1×PBS稀释，将步骤（5）后的病毒上清通过湿润的0.45μm孔径滤器过滤；此时滤过后的上清液中的病毒颗粒可以直接用于检测滴度或者感染目的细胞；（7）病毒浓缩：将步骤（6）后的病毒上清进行超速离心，18000rpm，2小时，4℃，弃上清后用100～200μL5wt.%Buffer C重悬，使用前用1×PBS稀释。