[发明专利]对JEV易感的猪扁桃体细胞系的构建方法在审
| 申请号： | 201910736306.6 | 申请日： | 2019-08-09 |
| 公开（公告）号： | CN110396502A | 公开（公告）日： | 2019-11-01 |
| 发明（设计）人： | 马志永;郗淑敏;刘珂;邵东华;魏建超;李蓓蓓;邱亚峰 | 申请（专利权）人： | 中国农业科学院上海兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心上海分中心） |
| 主分类号： | C12N5/10 | 分类号： | C12N5/10;C12N15/867;C12N15/65 |
| 代理公司： | 北京众合诚成知识产权代理有限公司 11246 | 代理人： | 马超前 |
| 地址： | 200241 *** | 国省代码： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 猪扁桃体 细胞 慢病毒颗粒 阳性细胞 嘌呤霉素 构建 感染 培养液 传代 慢病毒载体 辅助包装 扩大培养 上皮细胞 宿主细胞 细胞筛选 扁桃体 血清 转染 敏感 研究 | ||
1.一种对JEV易感的猪扁桃体细胞系的构建方法，其特征在于，该方法包含：
获得原代猪扁桃体细胞，并在5％FBS的DMEM/F12培养基中进行培养，该培养基中添加100U/mL的青霉素和100μg/mL的链霉素；
以pHY-sv40-Puro作为慢病毒载体，以psPAX2和pCMV-VSV-G作为辅助包装载体，共同转染进入293T细胞中，获得含有慢病毒载体pHY-SV40-Puro的慢病毒颗粒，并采用2％FBS的DMEM培养；
将所述慢病毒颗粒感染经培养后的原代猪扁桃体细胞系；
经过所述感染后，将猪扁桃体细胞在含血清的DMEM/F12培养液中并添加嘌呤霉素进行细胞筛选，该嘌呤霉素的浓度为其对正常猪扁桃体细胞的最小致死浓度，获得阳性细胞；
将所述阳性细胞用不含嘌呤霉素的5％FBS的DMEM/F12培养基扩大培养，构建得到对JEV易感的猪扁桃体细胞系。
2.根据权利要求1所述的对JEV易感的猪扁桃体细胞系的构建方法，其特征在于，所述原代猪扁桃体细胞的制备包含：将所需的猪扁桃体部位于无菌平皿内，去除结缔组织，用Hank's液洗涤，剪碎，加入Hank's液，移入无菌三角烧瓶内，使细胞分散，静止，收集上层细胞悬液。
3.根据权利要求1所述的对JEV易感的猪扁桃体细胞系的构建方法，其特征在于，所述慢病毒颗粒的制备包含：
将经所述转染的293T细胞培养，48小时后第一次收集上清液，再培养24小时，收获上清液和细胞，并与前述第一次收集的上清液混合；
反复冻融使细胞破裂，过滤，收集上清液，将该上清液与PEG8000混合，获得沉淀并用DMEM培养液溶解，获得所述慢病毒颗粒。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的对JEV易感的猪扁桃体细胞系的构建方法，其特征在于，所述感染时，加入凝聚胺。
5.根据权利要求4所述的对JEV易感的猪扁桃体细胞系的构建方法，其特征在于，所述凝聚胺的浓度为5μg/mL。
6.根据权利要求1-3中任意一项所述的对JEV易感的猪扁桃体细胞系的构建方法，其特征在于，所述扩大培养50代以上。
7.根据权利要求1-3中任意一项所述的对JEV易感的猪扁桃体细胞系的构建方法，其特征在于，经过所述感染后，将猪扁桃体细胞在含浓度为5％的Bioind透析型胎牛血清DMEM/F12培养液中。
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