[发明专利]一株产正丁酸的大肠杆菌工程菌的构建及应用有效

专利信息
申请号: 201910738599.1 申请日: 2019-08-12
公开(公告)号: CN110438056B 公开(公告)日: 2021-05-28
发明(设计)人: 陈修来;郭亮;刘立明;刁文文;刘佳;罗秋玲 申请(专利权)人: 江南大学
主分类号: C12N1/21 分类号: C12N1/21;C12P7/52;C12R1/19
代理公司: 哈尔滨市阳光惠远知识产权代理有限公司 23211 代理人: 彭素琴
地址: 214000 江苏*** 国省代码: 江苏;32
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摘要:
搜索关键词: 一株产正 丁酸 大肠杆菌 工程 构建 应用
【说明书】:

发明公开了一株产正丁酸的大肠杆菌工程菌的构建及应用,属于发酵工程技术领域。本发明以Escherichia coli ATCC 8739为出发菌株,利用代谢工程手段,通过构建丁酸的合成路径以及切断冗余代谢支路构建了生产丁酸的大肠杆菌基因工程菌。在发酵72h后丁酸的产量达到15g/L。该发酵过程为好氧发酵,菌体生长快,发酵周期短,产酸速率高,目前未见直接利用甘油发酵生产丁酸的报道。该方法采用的发酵工艺简单,易于控制,生产成本低,有利于工业化生产的推广和应用。

技术领域

本发明涉及一株产丁酸的大肠杆菌工程菌的构建及应用,属于发酵工程技术领域。

背景技术

丁酸(Butyric acid)是一种短链脂肪酸,是合成其他香料物质和精细化工产品的重要原料。丁酸及其衍生物被广泛应用于化工、食品、医药、动物饲料和化妆品等行业。丁酸衍生物,如丁酸酯,用于饮料、食品和化妆品中作为芳香和增味剂。由丁酸和醋酸纤维素制备的聚合物可用于制造塑料和纺织纤维。丁酸盐的衍生物作为高活性化合物,显示出具有抗癌作用。此外,丁酸的商业价值因其作为生物燃料(如正丁醇)的前体而备受推崇。

目前,丁酸的生产方法主要有化学法和发酵法。化学法是采用源于石油化工的正丁醛氧化法。与化学法相比,生物发酵法具有原料广泛、环境友好和可持续等优点,发酵法主要以淀粉或糖为原料,用丁酸梭状芽孢杆菌发酵得丁酸。

丁酸梭状芽孢杆菌是严格厌氧的革兰氏阳性菌,长期以来一直被研究用于生产丁酸。然而,丁酸梭状芽孢杆菌发酵过程复杂,发酵条件难以控制,操作步骤繁琐,需要仔细优化影响丁酸产量的关键因素。此外,可用于丁酸梭状芽孢杆菌的遗传操作工具和其生理信息少也阻碍了其发展。而大肠杆菌由于其生长过程已于控制,遗传操作工具成熟,遗传背景清晰。但目前应用大肠杆菌生产丁酸,是以葡萄糖和乙酸为底物,发酵48h,产量为10g/L左右(Journal of Agricultural and Food Chemistry,2014,62(19):4342-4348)。

甘油(glycerol)学名丙三醇,是一种三元醇。随着化石燃料日趋紧张,国际油价持续上涨,人们环保意识随之增强且越来越注重研究开发可再生的替代能源,生物柴油是一个有希望替代的可再生燃料,其生产的原料主要包括动植物的油脂和餐饮方面的垃圾油,在水解制备生物柴油的同时,将会生成一定量的甘油。近年来,生物柴油的发展速度加快,副产物甘油的产量也在迅速上升,这将使得甘油的价格大幅下降。此外,工业化制皂的过程中,闭合的皂胶经盐析后,下层溶液中也含有副产物甘油。如此大量的甘油生成将会给生物柴油行业带来严重负担,增加生产成本。相比于高额的处理成本,如果能够高效充分利用这些甘油转化成需要的高附加值化合物将带来巨大的效益,降低生物柴油制造的成本,减少资源的浪费、污染物排放以及环境污染等。若能采用微生物发酵直接利用甘油生产丁酸,则可以解决上述问题和不足。

丙酮酸是合成丁酸的前体物质,获得能够积累丙酮酸的菌株是发酵法生产丁酸的必要前提。

综上所述,提供一种以甘油为底物发酵生产正丁酸的低污染、低成本的方法,对于正丁酸的工业生产具有重要的应用价值。然而,目前该方法还未见报道。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种基因工程菌,是对出发菌株大肠杆菌(Escherichia coli)进行基因工程改造获得的菌;所述基因工程改造为不表达乙酸激酶基因(ackA)、乙醇脱氢酶基因(adhE)和乳酸脱氢酶基因(ldhA),并游离过表达乙酰乙酰辅酶A硫解酶基因(atoB)、3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶基因(hbd)、3-羟基丁酰辅酶A脱水酶基因(crt)、反式烯酰辅酶A还原酶基因(ter)和酰基辅酶A硫酯酶II基因(tesB)。所述不表达包括敲除或沉默。

在本发明的一种实施方式中,所述出发菌株包括大肠杆菌(Escherichia coli)ATCC 8739。所述Escherichia coli ATCC 8739是在ATCC上购买的野生型大肠杆菌。

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