[发明专利]基因文库的构建方法、待测核酸样本基因突变的检测方法及试剂盒

权利要求书

1.一种基因文库的构建方法，其特征在于，包括：

基于待测核酸样本，进行末端修复，加A，以便获得经修复的末端加A的核酸样本；

将所述经修复的末端加A的核酸样本和组合标签接头进行连接，以便获得连接有组合标签接头的核酸样本；

基于所述连接有组合标签接头的核酸样本，进行第一扩增，以便获得所述测序文库；

其中，所述组合标签接头含有组合标签和接头序列，所述组合标签包括至少两组标签，所述至少两组标签的每一组含有至少两个标签序列，

所述至少两组标签的每一组内任意标签序列间的汉明距离大于等于2，优选大于等于3，

所述至少两组标签的每一组间任意标签序列间的汉明距离大于等于1，优选大于等于2。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述标签序列为4～10个碱基，优选为4～6个碱基；

任选地，所述标签序列的GC含量为20％～80％，例如为50％；

任选地，所述标签序列上任意位置处碱基A、T、C、G占比分别为25％；

任选地，所述标签序列不含有连续3个相同的碱基；

任选地，所述至少两组标签的每一组标签用于标记同一个样本。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述组合标签接头选自下列中的至少一组：

SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:4；

SEQ ID NO:5～SEQ ID NO:8；

SEQ ID NO:9～SEQ ID NO:12；

SEQ ID NO:13～SEQ ID NO:16；

SEQ ID NO:17～SEQ ID NO:20；

SEQ ID NO:21～SEQ ID NO:24；

SEQ ID NO:25～SEQ ID NO:28；

SEQ ID NO:29～SEQ ID NO:32。

4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述待测核酸样本的长度为200～300bp，所述待测核酸样本为福尔马林固定石蜡包埋样本或外周血循环肿瘤DNA。

5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，进一步包括：

在对所述待测核酸样本进行末端修复之后，加A之前，或者将所述经修复的末端加A的核酸和组合标签接头进行连接之后，利用磁珠进行纯化，采用含有非离子表面活性剂的DNA溶解液对所述纯化产物进行洗脱；

任选地，所述非离子表面活性剂为tween20。

6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，利用DNA末端修复酶混合液进行所述末端修复，所述DNA末端修复酶混合液包括：聚合酶和多聚核苷酸激酶，所述聚合酶包括T4DNA聚合酶和Klenow大片段，所述多聚核苷酸激酶为T4多聚核苷酸激酶。

7.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，利用引物进行所述第一扩增，所述引物的部分序列能够与所述组合标签接头的部分序列进行互补配对，所述引物上含有分子标签序列；

任选地，进一步包括：利用寡核苷酸对所述组合标签接头进行封闭，所述寡核苷酸能够与所述组合标签接头的至少部分组合标签序列进行互补配对。

8.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，在所述第一扩增之后进一步包括：

利用液相探针对所述扩增产物进行杂交捕获，以便获得目标区域产物；

基于所述目标区域产物进行第二扩增，以便获得所述测序文库。