[发明专利]一种环状芽孢杆菌分离鉴定方法

说明书

本发明提供了一种环状芽孢杆菌分离鉴定方法，包括以下步骤：(1)使用选择性增菌培养基对含有环状芽孢杆菌的环境菌进行选择性增菌培养，降低非环状芽孢杆菌增殖，使环状芽孢杆菌高效增殖，所述选择性增菌培养基为含有头孢菌素类抗生素和青霉素钾的改良胰蛋白胨大豆肉汤培养基；(2)将步骤(1)所得菌液在含有抗生素的哥伦比亚血琼脂平板培养，对出现溶血环的菌株进行分离，根据菌落形态进行鉴别。所述方法可进一步使用分子生物学方法对步骤(2)分离得到的菌株进行鉴定。本发明可简单快速的从环境菌对环状芽孢杆菌进行分离鉴定，具有较高的筛查精度。

技术领域

本发明属于微生物检测领域，具体涉及一种环状芽孢杆菌分离鉴定方法。

背景技术

芽孢杆菌属 （Bacillus）是一种革兰阳性、有氧或兼性厌氧的内生孢子杆状细菌，因产抗逆性内生孢子，使芽孢杆菌属的微生物能够抵抗各种极端环境，如高温、极酸、极盐，且对各种杀菌剂具有抵抗力。芽孢杆菌包括枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌、多粘芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌等近50种。

常规对芽孢杆菌属的检测方法是根据菌落、菌体特征结合菌种鉴定材料进行判断， 而面对表型特征不明显或含有多种微生物的样品时容易出现误判现象，这些传统的微生物鉴定方法不能满足样本检测中的快速、准确的需要。基于DNA序列的特异(引物) 分子生物学技术是当今快速、准确鉴定菌种的方法之一。然而，当环境菌中杂菌数量过多时，大大增加了鉴定的工作量，导致工作效率低下。

环状芽孢杆菌是一种芽孢杆菌属条件致病菌，常在被土壤污染的食物以及食品包装用纸中筛出。为了保证食品包装用纸安全，对环状芽孢杆菌进行快速高效的分离鉴定具有很强的应用价值和社会意义，目前还没有可简单快速对环状芽孢杆菌从环境菌中进行分离鉴定的方法。

发明内容

本发明克服现有技术的缺点与不足，提供一种简单快速的环状芽孢杆菌分离鉴定方法。

本发明具体技术方案如下：

一种环状芽孢杆菌分离鉴定方法，包括以下步骤：

（1）使用选择性增菌培养基对含有环状芽孢杆菌的环境菌进行选择性增菌培养，降低非环状芽孢杆菌增殖，使环状芽孢杆菌高效增殖，所述选择性增菌培养基为含有头孢菌素类抗生素和青霉素钾的改良胰蛋白胨大豆肉汤培养基；

（2）将步骤（1）所得菌液在含有抗生素的哥伦比亚血琼脂平板培养，对出现溶血环的菌株进行分离，根据菌落形态进行鉴别。

本发明选择改良胰蛋白大豆肉汤作为基础培养基而不选用芽孢杆菌的增菌培养基，目的是为了降低其他高营养需求的芽孢杆菌的优势增殖。

优选的，所述步骤（1）选择性增菌培养基还可以通过高盐和调节pH抑制大部分不耐盐不耐碱细菌的生长，高效增强环状芽孢杆菌增殖。优选的，使用质量百分比7%的NaCl%，调节选择性增菌培养基pH=8。

本发明所述头孢菌素类抗生素优选为头孢噻呋或其盐，如所述头孢噻呋钠，优选选择性增菌培养基中头孢噻呋或其盐的含量为50-500μg/mL，青霉素钾含量为10-30U/mL。

更优选的，所述步骤（1）选择性增菌培养基还可以含有多黏菌素和/或萘啶酮酸或其盐，如萘啶酮钠，进一步抑制杂菌的生长。

本发明使用头孢菌素类抗生素、多黏菌素和/或萘啶酮酸或其盐抑制杂菌生长，使用青霉素钾使环状芽孢杆菌相对于其他芽孢杆菌优势增长，有利于后续的平板分离鉴定。

本发明所述的环状芽孢杆菌分离鉴定方法，所述步骤（2）抗生素为香豆素类抗生素和/或萘啶酮酸或其盐，如萘啶酮钠。优选的，香豆素类抗生素为新生霉素。

本发明所述的环状芽孢杆菌分离鉴定方法，所述步骤（1）和（2）的培养温度为36℃，培养24小时。