[发明专利]一种应用基因组重排技术筛选庆大霉素高产菌株选育的方法

说明书

本发明公开了一种应用基因组重排技术筛选庆大霉素高产菌株选育的方法，具体包括选育基因组重排的亲本菌株、基因组重排以及检测，其中基因组重排包括原生质体制备、原生质体紫外灭火和热灭活等步骤，本发明效果显著，可用于绛红色小单孢菌优良菌株的筛选，改善现有的筛选方法，加快选育速度，提高发酵液的效价、发酵产量。

技术领域

本发明涉及生物领域，尤其是涉及一种应用基因组重排技术筛选庆大霉素高产菌株选育的方法。

背景技术

庆大霉素，是一种氨基糖苷类抗生素，属广谱抗生素范围，对革兰氏阴性菌（G-）和革兰氏阳性细菌（G+）都有较好的抑制作用。此抗生素应用范围较广泛，特别是对绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌有较好的抗菌效果。由绛红色小单孢菌产生的庆大霉素是一种复合物，包括C组份、A、B、X等，各成份均有其独特的作用，氨基糖苷类抗生素还具有抗HIV等功效。近年来，庆大霉素的生产工艺不断完善，但是菌种退化严重，造成产量较低，效价不高等问题，高产菌株的筛选工作迫在眉睫，传统的自然筛选方法时间较长，效果不明显，急需寻求一种新方法加速筛选工作。

近几年基因组重排技术发展迅速，是一种快速高效的微生物育种方法，是在传统分子重组育种的基础上于1998年提出的一种分子育种方法。基因组重排技术是针对整个菌株进行操作,这项技术的前提是已经获得性状优良的突变菌株，然后进行杂交育种，增加不同正向突变整合到一个重组子中的机会,提高育种效率。采用基因组重排技术选育高产洛伐他汀红曲菌株，获得一株遗传稳定、高产洛伐他汀菌株Ｒ″-30，洛伐他汀产量较原始菌株SH2-7提高52%。在多杀菌素产生菌的筛选中，使用多轮基因组重排技术，获得1株产量较出发菌株提高了36.07%且遗传稳定的融合株。

绛红色小单孢菌属于放线菌的一种，小单孢菌革兰氏染色呈阳性，孢子壁和菌丝体的细胞壁较厚，肽聚糖结构致密、层次多。在绛红色小单孢菌的筛选中，主要以自然筛选和诱变（等离子体诱变ARTP，紫外诱变等）为主，因其细胞壁较厚，诱变效果不明显，同时长期使用诱变剂，菌株自身抗性会得到增强，最终造成菌株产生“疲劳效应”。通过去除细胞壁的方法，提高诱变效率，同时结合基因重组重排的方法，快速、高效地将优良菌株的不同性状集中在一处，获得产量较高的绛红色小单孢菌新菌株。

目前生产庆大霉素的原始菌株经过多年传代退化较为严重，因此需要为了获得高产量的绛红色小单孢菌，改善现有的筛选方法，加快选育速度，提高发酵液的效价、发酵产量。

发明内容

本发明为克服上述情况不足，旨在提供一种能解决上述问题的技术方案。

一种应用基因组重排技术筛选庆大霉素高产菌株选育的方法，具体包括以下步骤：

S1、制备0.9％ 生理盐水、20% 氯化锂溶液、邻苯二甲醛（OPA）衍生剂、试验标准品、流动相以及培养基；

S2、选育基因组重排的亲本菌株，无菌条件下，取斜面一支，加入20ml 0.9％生理盐水将孢子全部洗下，吸入带玻璃珠的锥形瓶中，220rpm 35.5℃条件下摇20min，过滤，装入50ml离心管中，震荡混匀，吸取2ml于甘油管中，4℃条件下保存；取500μl孢子悬浮液，加入250μl 20%氯化锂，250μl超纯水，振荡5min，取20μl孢子悬浮液，诱变仪诱变60s，加入980μl生理盐水，存放于灭菌的离心管中，4℃保存；

S3、基因组重排，具体包括原生质体制备、原生质体紫外灭火和热灭活以及基因组重排；

原生质体制备：取步骤S2获得的诱变孢子悬浮液5ml，接入含0.3％甘氨酸种子培养基，35.5℃培养48h，过滤收集菌丝体，用0.3mol/L蔗糖洗涤3次，P液洗涤1次后，重悬于P稳定液中,每毫升中加入6mg，37℃水浴2h左右，取样镜检，观察到大部分菌丝裂解后，用胶头滴管吹打几次，使原生质体和细胞壁分离，2000r离心10分钟用P液洗涤2次后备用。计算原生质体形成率,公式如下：

原生质体形成率=（A-B）/A；