[发明专利]一种团头鲂MSTNab基因敲除的gRNA及其模板

说明书

本发明公开一种基于CRISPR/Cas9系统的gRNA，CRISPR/Cas9系统的靶点序列是针对MSTNa的第一外显子和第三外显子的靶点序列，和/或针对MSTNb的第一外显子和第三外显子的靶点序列。本发明还公开了一种基于CRISPR/Cas9系统的gRNA模板，gRNA模板能够转录成前述gRNA。通过前述gRNA基因敲除后能提高团头鲂肌肉生产性能。

技术领域

本发明属于水产养殖领域，涉及CRISPR/Cas9技术在经济养殖鱼类团头鲂MSTNab基因敲除中的gRNA及其模板与应用。

背景技术

CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeatsand CRISPR associated 9)已经成为基因功能研究中强大高效的工具^[1]。目前的基因编辑手段主要是TALEN、ZFNs和CRISPR/Cas9 这三大类^[2]，CRISPR/Cas9系统因其基因编辑效率高、设计简单易行、省时省力等优势，现已成功应用于鼠^[3]、果蝇^[4]、斑马鱼^[5,6]、线虫^[7]和拟南芥^[8]等各种模式生物。CRISPR/Cas9是基于原核生物对外源的遗传物质而产生的免疫系统^[9]，在特定的guide RNA(gRNA)的引导下，CAS蛋白可以结合降解外源的DNA，从而来保护自己的基因组的完整性不受破坏。实验过程中，伴随着靶点DNA的断裂，随之会有同源重组(HR)和非同源末端连接(NHEJ)这两种修复机制运作^[10]。由于随机的缺失和插入，其中NHEJ修复会在断裂处形成移码突变从而敲除掉内源基因。而HR机制会在缺口处定点敲入进去事先准备好的外源基因^[11]。在过去5年间，随着CRISPR/Cas9基因编辑系统的广泛推广应用，大量研究已经证实只需要体外共注射gRNA和 Cas9mRNA^[12,13]或者CAS9蛋白^[14-16]，均可导致目标基因的破坏。 CRISPR系统是以RNA作为基因组定位工具,深得很多科研工作者的喜爱。

Myostatin(MSTN)即肌肉生长抑制素基因，1997年在小鼠中首次发现，亦称为GDF8，为TGF-β家族基因的成员^[17]，后来经研究发现GDF8对骨骼肌生长的负调控效应，故更名为Myostatin^[18]，MSTN 基因的作用机制是通过蛋白酶来酶切MSTN前体蛋白，形成以非共价结合的N端前肽和C端活性成熟肽，MSTN能够通过结合Smad蛋白调控Myogenin使成肌细胞停留在G0/G1和G2期，从而阻碍成肌细胞的分化和增生^[19,20]。然后相继又克隆到了MSTN基因从鸟类^[21]、牛、猪和其他哺乳动物中^[22,23]。

团头鲂(Megalobrama amblycephala)是我国重要的淡水养殖种类中草食性经济鱼类之一^[24]，具有不耐低氧的弊端^[25]，除此之外，也有一些生长相关的基因调控机制限制着鱼类的年产量^[18]。随着近年水产养殖中来近交衰退现象的出现^[26]，提高团头鲂的肌肉品质及生长效率也是良种选育工作的目标之一。

参考文献：