[发明专利]一种大肠杆菌DH5α高效感受态细胞的制备方法

说明书

本发明公开了一种大肠杆菌DH5α高效感受态细胞的制备方法，其将融化的大肠杆菌在不含抗性的LB固体培养基平板上涂板，并培养；在长出大肠杆菌的单克隆的菌落后挑取，并在不含抗性的LB固体培养基平板上划线分离，在培养后在划线处长出菌苔后挑取一条放入装有灭菌LB液体培养基的第一容器中，再振荡得到第一混合菌液；将第一混合菌液移至装有灭菌LB液体培养基的第二容器中，再振荡得到第二混合菌液；对第二混合菌液离心去上清；用CaCl₂溶液重悬得到第一重悬液；对第一重悬液离心去上清；用CaCl₂溶液重悬得到第二重悬液；对第二重悬液离心去上清；用CaCl₂溶液重悬得到第三重悬液，即得到大肠杆菌感受态细胞；优点是其操作简单快速、可重复性高、转化效率高。

技术领域

本发明涉及一种分子生物学技术，尤其是涉及一种大肠杆菌DH5α高效感受态细胞的制备方法。

背景技术

转化是将外源DNA片段直接转入受体细菌中，使之获得新的遗传性状的过程。转化是现代分子生物学最基本的操作技术，是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。人工构建的质粒载体不能自行完成到受体细菌的转移。如果需要将质粒载体转移进受体细菌，则需要经一些特殊方法处理受体细菌，使之成为允许外源DNA进入的感受态细胞。

感受态细胞的制备是分子生物学研究中的一个重要环节。感受态细胞的状态、转化效率的高低会直接影响前后实验的进展和工作效率。目前，常见的大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备方法有CaCl₂法、Hanahan法和Inoue法。CaCl₂法是目前实验室制备感受态细胞的常规方法，其简便易行，但是制备所得的感受态细胞的转化效率较低；Hanahan法的可重复性低；Inoue法的转化效率高，但是，一方面其对细菌的OD₆₀₀值要求比较严格，导致操作过程比较繁琐，且操作时间比较长，另一方面，其培养温度是18℃，导致细菌生长缓慢，从而导到培养出大肠杆菌DH5α的效率较低。

因此，研究一种简单快速、可重复性高、转化效率高的适用于普通实验室的感受态细胞制备方法，对分子生物学的研究尤为重要。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种大肠杆菌DH5α高效感受态细胞的制备方法，其操作简单快速、可重复性高、转化效率高。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种大肠杆菌DH5α高效感受态细胞的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

步骤一：将-80℃～-70℃下冷冻保藏的大肠杆菌置于超净台上，并在室温环境下融化大肠杆菌；然后将融化的大肠杆菌在第一块不含抗性的LB固体培养基平板上涂板；再在37℃的恒温培养箱中培养，直至在第一块不含抗性的LB固体培养基平板上长出大肠杆菌的单克隆的菌落；

步骤二：在第一块不含抗性的LB固体培养基平板上长出大肠杆菌的单克隆的菌落后，挑取大肠杆菌的单克隆的菌落，并在第二块不含抗性的LB固体培养基平板上划线分离；然后在37℃的恒温培养箱中培养，直至划线处长出菌苔；接着挑取一条菌苔，并放入装有10ml～15ml的灭菌LB液体培养基的第一容器中；再将第一容器置于摇床上，在37℃下并以210rpm～240rpm的速度振荡，直至扩大培养得到的第一混合菌液的OD₆₀₀值为1.5～2.2；

步骤三：将第一混合菌液转移至装有灭菌LB液体培养基的第二容器中，其中，第一混合菌液与灭菌LB液体培养基的体积比为1:20；再将第二容器置于摇床上，在37℃下以210rpm～240rpm的速度振荡，直至扩大培养得到的第二混合菌液的OD₆₀₀值为0.6～0.8；

步骤四：将第二混合菌液倒入预冷的离心管中；然后将离心管置于预冷的离心机上，以3500rpm～4000rpm的速度离心处理6～10分钟后，再去掉上清，第一次收集大肠杆菌；