[发明专利]一种快速筛选苹果红肉性状的分子标记的开发方法及应用

权利要求书

1.一种快速筛选苹果红肉性状的分子标记的开发方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、实验材料准备：

实验材料选用I型红肉苹果R6R6纯合Red3×长富二号R1R1纯合子一代杂合分离群体，树龄均为6年，均为嫁接在M26砧木上的嫁接苗；

用于提取DNA的植物材料样本于6月采集，每个个体取嫩叶或嫩芽收集，采集完毕后在液氮中速冻，使用锡纸袋包装后置于-80℃冰箱保存；果实材料于7月开始收集，通过碘染色法来确认果实是否成熟，每周采收成熟果实，每株采三个生物学重复，每个生物学重复视结果情况采5-15个果实；果实采收后削皮去核，将果肉充分研磨混匀后在液氮中速冻，用锡纸袋包装后置于-80℃冰箱保存；

步骤2、高效液相色谱仪测定果实花色苷含量

将果实样本从冰箱取出，每棵树的果实粉末分装至三个包装内做生物学重复；

步骤3、SLAF文库构建及测序

3.1植物基因组DNA提取

植物基因组的提取使用植物基因组DNA提取试剂盒；

3.2 SLAF文库构建及测序

SLAF测序文库构建的方法；首先根据实验所用群体的基因组大小以及GC含量的信息，选取合适基因组进行酶切预测，并且基于实验数据计算两个相邻的限制酶切割位点，以使限制酶能产生高质量、丰富、无重复的位点，并且均匀分布在基因组上为原则预测；为保证不同片段的测序深度一致，选择有限范围的片段测序，PCR扩增之后使用凝胶评估片段大小；如果在凝胶上没有检测到类似的特异性扩增条带，则需要重新设计预实验方案；

基因组DNA使用Rsa I和Hae III酶切，364-464bp的片段按操作手册上描述的方法从胶上切离、纯化并扩增；随后再连接Dual-index测序接头、纯化稀释使用北京百迈客生物技术公司进行PE125bp测序；每个测序循环实时监控，保证Reads的质量值高于Q30；此外，GC含量也被用于评估测序Reads的质量；

3.3SLAF数据分析及基因分型

SLAF测序数据的方法进行分析并分型；次要等位基因MAF被用来计算确定在每一个SLAF位点的等位基因；由于苹果是二倍体，每一个SLAF位点应该包括不超过4个标签，因此，超过4个标签的SLAF位点需要被筛除；包含2、3或4个标签的SLAF位点是多态性的，具有被开发为分子标记的潜力；

步骤4、高密度遗传连锁图谱构建及QTL定位

将所述由169个个体组成的F1群体数据使用JoinMap4.0软件构建遗传连锁图谱；分子标记间的遗传距离使用Kosambi作图函数计算，表示为厘摩cM距离；将分离标记在不同的连锁群上的LOD阈值设置为10；先分别构建亲本的遗传连锁图谱，之后再使用CP群体模型基于父母本的数据建立每个连锁群一致的图谱；QTL分析使用MapQTL5.0软件；果肉花色苷含量的候选QTLs检验使用Kruskal-Wallis，使用区间作图确定；使用1000个置换测试在95％全基因组LOD值下计算显著水平。

2.根据权利要求1所述的快速筛选苹果红肉性状的分子标记的开发方法，其特征在于，步骤2具体为：具体操作如下:

1)使用液氮预冷实验用具，如镊子、捣锤、研钵和称量杯；

2)称取0.55g的果肉于液氮预冷之后的研钵，记录称量的重量；

3)待液氮蒸发完全后，加入1.5mL酚类提取液充分研磨；

4)液体装入离心管中，4℃、12000rpm离心15min，若沉淀不充分则适当延长时间

5)用注射器吸取上层清液，使用0.22μm有机溶剂过滤滤头过滤，装入2μL液相色谱样品瓶。

提取完毕后，使用使用岛津LC-2010AHT型高效液相色谱仪进行花色苷含量分析；分配色谱柱使用InertSustain AQ-C18保护柱，流动相A为10％的甲酸水溶液，流动相B为10％的甲酸乙腈溶液；柱温30℃，流速1.0mL/min，进样量2μL；在520nm波长下检测矢车菊素-3-半乳糖苷的吸光度；根据标样在分离柱中保留时间的标准曲线方程来确定待测物质的含量，标准曲线根据不同浓度标准样品出峰面积计算得到。